徐小川，姚 源，田 偉，石 銳，陳大福，張秀麗

（1.北京積水潭醫(yī)院口腔科，北京 100035；2.北京市創(chuàng)傷骨科研究所，北京 100035；3.北京市第六醫(yī)院口腔科，北京 100007）

海藻酸鹽是從海洋褐藻中提純的天然多糖，應用在制藥和生物醫(yī)學工程領域［1－3］，缺點是在生理環(huán)境下容易失去物理性狀，而且對蛋白質吸附能力不佳，從而限制了其深入應用于上述領域；淀粉是陸生的天然多糖，其價格不足前者的1／10。增塑淀粉（thermoplastic starch）是北京市創(chuàng)傷骨科研究所參與研發(fā)的生物可降解材料，比普通淀粉的彈性和強度都有所增加。該材料具有分子量大、對小分子物質有超強包容性、凝膠化能力強等特點，因而可替代海藻酸鹽作為可降解材料，若加入止血劑或骨形成蛋白等因子則可用作止血、誘導成骨等組織工程材料［4］，有望在生物醫(yī)藥、組織工程領域廣泛應用［5］。

宿主微環(huán)境中物理、化學、生物因素對生物材料的降解和轉歸有很大影響，建立能模擬宿主體內微環(huán)境的研究平臺，從事可重復、可控的體外實驗，將使材料的評估更加客觀［6］。但具體評價方法和指標尚無法達成共識［7］，因此，本實驗依照醫(yī)療器 械 標 準 YY／T 0127.2－93［8］、YY／T0127.1－93 及 ISO／TR7405－1984［9］、YY／T 0244－1996［10］有關規(guī)定，從急性全身毒性反應、溶血實驗、短期全身毒性試驗3種方法對其生物安全性進行初步評價研究。

1 材料與方法

1.1 急性全身毒性反應［8］

1.1.1 材料 增塑淀粉4g（北京化工大學提供），置入有20 mL生理鹽水的三角瓶，經37℃浸提72h制成浸提液。小白鼠雌雄各10只，體質量17～23g。

1.1.2 方法 小鼠雌雄隨機分為實驗組和對照組，每組10只。實驗組小鼠腹腔恒速（不超過0.1mL／s）注射浸提液50 mL／kg，對照組注射同批號滅菌生理鹽水，于注射后24、48、72 h觀察和記錄實驗組和對照組動物體質量、一般狀態(tài)、毒性表現和死亡動物數。

1.1.3 統(tǒng)計與分析 通過SPSS13.0軟件分析，考慮初始體質量、時間、組別進行具有一個協變量一個重復測量兩因素定量資料方差分析。

1.2 溶血實驗［8］

1.2.1 材料 增塑淀粉5g，經清洗處理后置燒瓶中加入生理鹽水10mL作為實驗組。陰性對照為同批號0.9%氯化鈉注射液，陽性對照為蒸餾水，各準備3瓶待測。

1.2.2 方法 將實驗組、陰性對照、陽性對照各組燒瓶置于37℃水浴中30min。然后在各瓶中加入新鮮稀釋兔血0.2 mL輕輕搖勻，在同溫水浴中維持60min，取上清液于545nm波長測定吸光度。溶血率計算公式：溶血率（%）＝［（實驗樣品的吸光度－陰性對照的吸光度）／（陽性對照的吸光度－陰性對照的吸光度）］×100%。

1.3 短期全身毒性試驗 經口途徑［8］。

1.3.1 實驗動物 12只SD大白鼠，體質量420～480g，隨機分為對照組和實驗組，每組6只，雌雄各半，并標記大鼠。

1.3.2 灌胃劑制備 將增塑淀粉制成濃度20%的混懸液，4℃環(huán)境保存待用。

1.3.3 灌胃 用連有灌胃針的注射器灌胃，給服劑量為每日1g／kg體質量，對照組給服同體積的浸提介質（0.9%生理鹽水）。記錄大鼠體質量并依此調節(jié)灌胃劑量，時間7d。停止灌胃后再連續(xù)測量體質量5d。

1.3.4 結果判斷及統(tǒng)計學處理 觀察大鼠的體質量變化、運動和呼吸狀態(tài)以及死亡情況。采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析處理，采用Wilcoxon秩和檢驗、考慮連續(xù)灌胃第7天體質量、時間、組別進行具有一個協變量、一個重復測量兩因素定量資料方差分析。

2 結 果

2.1 急性全身毒性反應結果 在24、48、72h觀察期內，兩組動物狀況良好，進食及運動如常，行動敏捷，無痙攣、運動障礙和死亡等毒性反應，體質量逐日增加。對兩組初始體質量（20.80±1.40，19.60±1.58）采用t檢驗，結果顯示兩組比較差異無統(tǒng)計學意義（t＝1.80，P＝0.09），說明兩組之間初始體質量具有可比性（表1）。兩組之間在24、48、72h體質量比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

初始體質量在統(tǒng)計學上的意義重大（F＝15.21，P＝0.000 3）（見表2），同一組各時間點之間有統(tǒng)計學差異（F＝10.19，P＝0.000 2），組別與各時間點之間比較無交互作用（F＝0.11，P＝0.894 3）。考慮初始體質量影響后，實驗組與對照組間24、48、72h體質量變化無統(tǒng)計學意義（P＝0.175 8，0.175 8，0.375 6），見表3。

表1 各組各時間點描述性統(tǒng)計分析結果體質量（g

表1 各組各時間點描述性統(tǒng)計分析結果體質量（g

組別 初始24h 48h 72h實驗組 20.80±1.40 21.80±1.48 22.80±1.40 24.20±1.75對照組 19.60±1.58 22.20±1.48 23.20±2.15 24.20±2.39

表2 考慮初始體質量、時間、組別進行具有一個協變量一個重復測量兩因素定量資料方差分析結果

表3 考慮初始體質量影響后兩組各時間體質量變化比較

2.2 溶血試驗結果 見表4。經計算增塑淀粉溶血率＝2.06%。

2.3 短期全身毒性試驗（經口途徑）結果 見表5。對灌胃后體質量變化分析如下（表6）：初始體質量在統(tǒng)計學上的意義重大（F＝219.30，P＜0.000 1），將組別因素和時間因素共同考慮時兩組比較差異無統(tǒng)計學意義（F＝1.42，P＝0.246 5），但各組間及各時間點間比較差異有統(tǒng)計學意義（F＝5.42，P＝0.044 9；F＝5.88，P＝0.000 8）。停止灌胃后兩組各時間點體質量變化見表7。

表4 增塑淀粉溶血吸光度值

表5 灌藥7d中兩組各時間點體質量比較

表5 灌藥7d中兩組各時間點體質量比較

時間 實驗組 對照組t P第1天436.33±34.72 443.67±31.23 －0.384 7 0.708 6第2天 425.33±37.43 442.33±28.66 －0.883 3 0.399 2第3天 423.00±32.81 441.67±30.81 －1.015 9 0.333 7第4天 417.00±36.22 442.33±31.07 －1.300 4 0.223 3第5天 416.33±34.30 438.67±33.03 －1.148 9 0.277 4第6天 409.00±34.77 433.33±30.16 －1.294 8 0.225 0第7天411.67±34.86 429.67±32.51 －0.925 1 0.376 8

表6 連續(xù)灌胃第7天體質量、時間、組別進行具有一個協變量一個重復測量兩因素定量資料方差分析

表7 停止灌胃后兩組各時間點體質量變化（g

表7 停止灌胃后兩組各時間點體質量變化（g

指標 實驗組 對照組t P第1天412.60±32.83 424.67±36.54 1.36 0.196 3第2天 415.60±33.86 423.00±35.30 2.30 0.038 6第3天 417.00±35.16 423.33±36.98 2.50 0.026 5第4天 419.00±36.55 424.33±36.43 2.70 0.018 1第5天420.67±35.72 431.00±40.77 1.70 0.113 5

3 討 論

對于接觸人體或在體內使用的生物材料，其化學性能將會直接影響人體的安全性。因此，對材料中的殘留單體、有害金屬元素、各種添加劑應嚴格控制。只有通過生物學評價來進一步確認這些用品是否安全，以便決定是否可以最終在臨床使用。一是動物體內實驗，即將材料植入體內，分階段將植入體與周圍組織取出，做組織學觀察；另一類為體外試驗，即用材料或材料浸提液觀察材料對組織細胞生長、代謝及增殖方面的影響［9］。1997年國家醫(yī)療器械生物學評價標準GB／T16886等采用ISO10993－1992標準，促進了中國生物醫(yī)用材料研究的發(fā)展和水平的提高［10］。生物學評價流程為首先進行體外生物學評價（如溶血試驗、細胞毒性試驗），根據結果對產品提出改性建議，合格后再進行體內動物學評價（如急性全身毒性、短期全身毒性）和動物實體模擬試驗，再根據體內試驗結果對產品提出進一步改進的建議，最后進行臨床研究。

血液相容性指標是針對植入物材料生物安全性的關鍵參數，但由于體內環(huán)境的復雜性及不確定性，目前尚無完善的評價標準。本實驗遵照國家YY／T0127.1－93的要求，采用直接接觸方法，測得材料的溶血率為2.06%（表4），指標在正常上限的50%以下，提示該材料優(yōu)于國家標準［8］。

在急性全身毒性和經口短期全身毒性中，除了動物體質量和死亡是可以明確判斷的指標外其余均屬于描述性語言，因而在動物零死亡且惟一的定量指標是“體質量”的情況下，引入統(tǒng)計學分析可以使結果更加有理可依。

急性全身毒性試驗中選用的統(tǒng)計學方式除了考慮初始體質量外，如急性全身毒性試驗初始體質量在統(tǒng)計學上的意義重大（表2，F＝15.21，P＝0.000 3），還加入了組別及時間因素綜合考慮，如同一實驗中組別與各時間點之間比較無交互作用（表2，F＝0.11，P＝0.894 3），在此基礎上顯示實驗組與對照組間24、48、72h體質量變化比較差異無統(tǒng)計學意義（表3，P＝0.175 8，0.175 8，0.375 6），避免了大量信息因統(tǒng)計學方法選擇不當而丟失，所得結果可信度大大提高。

短期全身毒性——經口途徑是醫(yī)藥行業(yè)標準中針對接觸骨組織、血液組織所必須的評價實驗［11］。采用 Wilcoxon秩和檢驗并考慮連續(xù)灌胃7d體質量、時間、組別進行具有一個協變量一個重復測量兩因素定量資料方差分析?？紤]組別和時間因素（表6，F＝1.42，P＞0.05）提示增塑淀粉對實驗動物未造成傷害。

停止灌胃2～4d兩組動物體質量有差異，可能的原因是對照組中一只動物灌胃致食道損傷引發(fā)體質量變化而產生偏倚，但在第5天體質量已無差別（t＝1.70，P＝0.113 5），提示灌胃產生的損傷2～3d才能恢復。

增塑淀粉作為替代海藻酸鹽的可降解組織工程材料，在體外和體內實驗中顯示了較好的安全性能，有研究將其與聚乙烯醇聯合制備為引導組織再生膜［5］明顯優(yōu)于聚乳酸和聚乳酸－羥基乙酸共聚物膜，進一步的材料學改善將使增塑淀粉盡快進入臨床試驗。

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