任凌雁，何 燕，張 婷，王嬋娟，王 歡，官志忠，單可人

（貴陽醫(yī)學院分子生物學重點實驗室，貴陽 550004）

貴州是一個多民族聚居的地區(qū)，有17個世居少數(shù)民族，其中苗族人口最多，占全國苗族總?cè)丝诘?0%左右。苗族人群線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）9bp序列缺失標記可能對追蹤該民族人群的親緣關(guān)系和遷移路線有所幫助。因為mtDNA 9bp缺失是一個非常有價值的多態(tài)性位點，其標準序列是2個串聯(lián)重復(fù)的9bp序列（CCC CCT CTA）［1］，有3種突變型：長型（標準序列前有4個C加入），短型（僅有單拷貝9 bp序列，即9bp缺失），3型（有3拷貝9bp重復(fù)）［2］。研究發(fā)現(xiàn)，mtDNA 9bp缺失是亞洲人及起源于亞洲的人種的特征［3］，其缺失頻率呈現(xiàn)的地理趨勢能很好地與史前該地區(qū)人類遷移路線相符，現(xiàn)將貴州3個地域苗族人群131例男性的mtDNA 9bp缺失頻率的檢測分析結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 采集來自貴州從江岜沙、黔西沙井、威寧龍街等3個地域苗族人群131例男性個體血樣，詳見表1。所選對象均為當?shù)亟】稻用瘢蚁?代內(nèi)為同一民族，彼此之間無親緣關(guān)系。采樣符合知情同意原則。血樣均為EDTA－K2抗凝，－70℃暫存至提取基因組DNA。

1.2 DNA提取、定量及標化 按常規(guī)酚－氯仿法抽提基因組DNA，溶于TE；紫外吸收法定量后取少量統(tǒng)一標化濃度為50 ng／μL，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 mtDNA 9bp的PCR擴增及PAGE檢測 依據(jù)mtDNA修訂的劍橋標準序列（revised cambridge reference sequence，rCRS）［4］，用軟件 Primer Premier5.0設(shè)計引物 P1／P2（序列見表2）進行PCR擴增。25μL PCR反應(yīng)體系組成為：10×PCR buffer 2.5μL，25mmol／L MgCl21.5μL，4×dNTP（每種2.5 mmol／L）2.0μL，10μmol／L引物各0.4μL，DNA聚合酶1.0 U，模板DNA 50ng。PCR循環(huán)條件：94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，循環(huán)30次。PCR產(chǎn)物用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，銀染后觀察結(jié)果。

表1 3個苗族人群樣本概況

1.4 mtDNA 9bp分型結(jié)果測序驗證 隨機選取經(jīng)PCRPAGE技術(shù)檢測為標準型和9bp缺失短型的樣本各5例，用引物P3／P4（序列見表2）進行PCR擴增，產(chǎn)物由北京鼎國昌盛生物技術(shù)公司完成序列測定。

2 結(jié) 果

2.1 PCR檢測結(jié)果 經(jīng)過PCR－PAGE檢測，131例樣本的PCR反應(yīng)產(chǎn)物的電泳圖譜中只檢測到2種基因型，分別為109 bp和100bp（圖1），分別對應(yīng)標準型和9bp缺失的短型。

表2 引物序列及其他參數(shù)

圖1 mtDNA regionⅤPCR產(chǎn)物的PAGE電泳圖

2.2 序列測定結(jié)果 結(jié)果顯示：標準型擴增產(chǎn)物的核苷酸序列與相對應(yīng)的劍橋序列一致，即存在2個串聯(lián)正向重復(fù)的9bp序列（CCC CCT CTA CCC CCT CTA），而9bp缺失短型擴增產(chǎn)物只有1個拷貝的9bp序列，即存在9bp缺失。見圖2（A、B均為反向測序圖）。

圖2 mt DNA Region V區(qū)序列分析結(jié)果（反向測序）

2.3 mtDNA 9bp缺失頻率 貴州岜沙、沙井、龍街3個地域苗族人群mtDNA 9bp缺失頻率見表3。

表3 貴州3個地域苗族人群mtDNA 9bp缺失頻率分布情況

3 討 論

姚永剛等［5］對中國多民族群體的研究發(fā)現(xiàn)，其缺失頻率由南向北、沿海向內(nèi)陸呈現(xiàn)遞減的梯度分布。不同地區(qū)不同民族的mtDNA 9bp缺失頻率是各異的。本研究的3個苗族人群的缺失頻率與臺灣的高山族（41.46%）［5］相比較低，與廣州漢族的缺失頻率相近（20.8%）［6］，而較中原民族如河南漢族的缺失頻率高（15.88%）［7］。北方的一些少數(shù)民族，如現(xiàn)代羅布人（8.3%）［8］、維吾爾族（3.3%）［9］、塔吉克族（1.43%）［10］缺失頻率均比本研究的這3個民族低，差異經(jīng)統(tǒng)計學分析已達到顯著水平（χ2＝8.845，χ2＝9.499，χ2＝23.324，P＜0.05），同一地區(qū)的不同民族其mtDNA 9bp缺失頻率是有區(qū)別的，如前期本課題研究貴州地區(qū)蒙古族（9.6%）、羌族（7.7%）［11］都低于本研究，并且差異有統(tǒng)計學意義（χ2＝8.280，χ2＝10.094，P＜0.05），水族［12］與本研究的苗族平均缺失率相近，而瑤族的缺失頻率高達58.2%［13］，高于本文的苗族平均缺失頻率，差異有統(tǒng)計學意義（χ2＝17.972，P＜0.05）；不同地區(qū)的同一民族其mtDNA 9bp缺失頻率也各異，廣西苗族缺失頻率為33.01%［14］，高于本研究，但差異無統(tǒng)計學意義。而貴州不同地區(qū)的苗族缺失頻率也是有所差別，本文3個地區(qū)的苗族缺失頻率就有所差異，其中從江岜沙苗族與黔西沙井苗族的差異有統(tǒng)計學意義（χ2＝5.623，P＜0.05）。苗族歷史悠久，由于戰(zhàn)爭、政治、經(jīng)濟等原因，歷史上曾經(jīng)歷過大幅度、遠距離、長時期的遷徙。自秦、漢時期有苗族先民進入貴州，經(jīng)過唐、宋、元、明、清千余年的流動和遷徙，苗族的分布初步形成了今天的格局［15］。世居苗族主要分布在黔、湘、滇、川、桂、鄂、渝等10個省區(qū)，而貴州省已成為苗族的主要聚居區(qū)，人口占全國苗族總?cè)丝跀?shù)的51.3%，是全省少數(shù)民族中人口最多的民族。苗族有自己的語言，屬漢藏語系苗瑤語族苗語支。苗語分3大方言，即東部方言、中部方言、西部方言。不同方言的人，語言互不相通。貴州從江屬中部方言的南部土語分支，貴州黔西屬西部方言川黔滇次方言，貴州威寧屬西部方言滇東北次方言，因此方言的隔離可能導致遺傳結(jié)構(gòu)有所差異。此外，從江縣所在的黔東南苗族侗族自治州有眾多的苗族、壯族，而貴州的少數(shù)民族有著大雜居、小聚居的特點，所以從江苗族與黔西苗族、威寧苗族有差異，并且與黔西苗族的差異有統(tǒng)計學意義，推測可能是黔東南苗族與本課題前期研究的當?shù)囟弊澹?3.54%）（數(shù)據(jù)另行報道）有基因交流所致。總之，本次對貴州苗族人群mtDNA 9bp缺失頻率的研究有助于貴州苗族人群遺傳結(jié)構(gòu)的組成，并進一步為貴州苗族的起源、遷徙過程奠定基礎(chǔ)。

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