蘭 天，常秀亭，勾紅菊，吳 騰，王麗京△，黃河清▲

（1.廣東藥學(xué)院血管生物學(xué)研究所，廣州 510006；2.中山大學(xué)藥學(xué)院，廣州 510006）

腎小球系膜細(xì)胞（glomerular mesangial cells，GMC）的增生、肥大及其功能改變?nèi)绶置诩?xì)胞外基質(zhì)是糖尿病腎病腎小球硬化的主 要 病 理 基 礎(chǔ)［1－2］。 磷 酸 鞘 氨 醇 （sphingosine 1－phosphate，S1P）是細(xì)胞膜組成成分磷脂的代謝產(chǎn)物，鞘氨醇激酶1（sphingosine kinase 1，SphK1）催化S1P生成，促進(jìn)細(xì)胞存活和保護(hù)細(xì)胞免受凋亡損傷［3－5］。研究發(fā)現(xiàn)，用糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）處理 GMC后，發(fā)現(xiàn)SphK1活性與S1P增高［6］。鑒于此，本研究采用鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）誘導(dǎo)的糖尿病腎損傷大鼠模型觀察其腎組織SphK1－S1P信號(hào)通路的變化，為探尋將SphK1－S1P信號(hào)通路作為抗糖尿病腎病的可能作用靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠（175～200g）購(gòu)自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，在SPF級(jí)環(huán)境下飼養(yǎng)，自由攝食、飲水。采用新鮮配制的鏈尿佐菌素（STZ）60mg／kg體質(zhì)量溶于10mmol／L枸櫞酸緩沖液，pH 4.5（Sigma公司），大鼠尾靜脈注射復(fù)制糖尿病模型。正常對(duì)照組注射等體積的枸櫞酸緩沖液。采用One－Touch Ultra血糖儀（Johnson ＆Johnson Co.，Milpitas，California，USA）檢測(cè)血糖。造模后72h測(cè)量空腹血糖，大鼠血糖濃度大于16.7mmol／L納入糖尿病模型標(biāo)準(zhǔn)。糖尿病模型組與正常對(duì)照組各8只大鼠，大鼠每周稱量體質(zhì)量，每月測(cè)量血糖。實(shí)驗(yàn)周期為12周。

1.2 生化分析 在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，稱大鼠體質(zhì)量，置于代謝籠收集24h的尿液。血肌酐和24h尿蛋白經(jīng)中山大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科分析。大鼠處死后，分離腎臟，稱重并一部分固定在4%的多聚甲醛溶液；另一部分液氮速凍后置于－80℃凍存。腎臟肥大指數(shù)用腎重體質(zhì)量比表示。

1.3 腎臟形態(tài)學(xué)研究 在實(shí)驗(yàn)結(jié)束、收取完尿液、血液與標(biāo)本，大鼠處死后、用PBS全身灌流，分離腎臟，然后在4%的多聚甲醛中固定過夜，石蠟包埋。切片4μm厚度進(jìn)行PAS染色。采用光鏡分析腎小球硬化程度和系膜區(qū)擴(kuò)展程度。用蘇木精染核后，每個(gè)切片觀察50個(gè)腎小球。通過計(jì)算腎小球橫切面來評(píng)價(jià)腎小球肥大。切片采用Olympus數(shù)字光學(xué)顯微鏡進(jìn)行拍照并轉(zhuǎn)換成數(shù)字圖片格式。腎小球橫切面采用圖像分析軟件Image Pro.Plus（Media Cybernetics，Inc.，Bethesda，MD，USA）進(jìn)行分析。每個(gè)動(dòng)物分析50個(gè)腎小球，計(jì)算均值并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 定量Real－time PCR檢測(cè)mRNA水平 按照TRIzolTM（Invitrogen）說明書提取組織或細(xì)胞的總RNA?？俁NA逆轉(zhuǎn)錄后，采用Bio－Rad iCycler Iq system進(jìn)行定量real－time PCR。用于擴(kuò)增的 引物序 列如下：SphK1（forward primer，5′－GGC AGC GAA CCC CAC CAC TC－3′；reverse primer，5′－GCG GGT GTC TGG TGA CTG GC－3′）；SphK2（forward primer，5′－CAC CTG TGC TGG GTG CGG AG－3′；reverse primer，5′－GGC AGC CCA GGC TGA AGT GG－3′）and GAPDH（forward primer，5′－AGG AGT AAG AAA CCC TGG AC－3′；reverse primer，5′－CTG GGA TGG AAT TGT GAG－3′）。mRNA水平采用GAPDH校正。熒光強(qiáng)度的平均閾值用于分析其mRNA水平。mRNA的相對(duì)量采用ΔΔCt進(jìn)行計(jì)算。

1.5 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 腎臟組織勻漿經(jīng)裂解提取蛋白后，經(jīng)SDS－PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)膜至PVDF。采用5%的脫脂牛奶室溫封閉1h，將一抗、二抗孵育后，采用增強(qiáng)型的化學(xué)發(fā)光液檢測(cè)條帶信號(hào)。膜重孵鼠單抗α－tubulin作為內(nèi)參對(duì)照。采用Quantity－One軟件進(jìn)行灰度分析。

1.6 鞘氨醇激酶活性測(cè)定 參考作者報(bào)道的方法進(jìn)行SphK1活性的液質(zhì)聯(lián)用（LC－MS／MS）法檢測(cè)［7］。30μg總蛋白液用于酶活性測(cè)定，反應(yīng)采用2.5μL 200μM C17－Sph（溶于5%Triton X－100）和2.5μL 20mM ATP含 MgCl2（200mM），總體積50μL。37℃水浴反應(yīng)20min后，用5μL 1MHCl和200μL氯仿∶甲醇∶濃鹽酸（100∶200∶1，v／v）終止反應(yīng)。然后加入10ng S1P作為內(nèi)標(biāo)。劇烈渦旋后，加入60μL氯仿和60μL 2MKCl，4℃，12 000g離心5min。下層的氯仿相轉(zhuǎn)移到新的1.5mL離心管，室溫真空干燥60min。揮干的殘?jiān)?00μL流動(dòng)相（methanol：0.1%formic acid＝95∶5，v／v）重懸，然后劇烈渦旋1min。終溶液進(jìn)樣10μL進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用（LC－MS／MS）（ThermoFinnigan）分析。

1.7 S1P含量測(cè)定 參照作者前期報(bào)道的方法［8］，用LCMS／MS法進(jìn)行S1P定量分析。稱量冰凍的腎臟組織樣本20 mg，用400μL的蒸餾水進(jìn)行電動(dòng)勻漿。細(xì)胞則用PBS刮取下來，離心，并用100μL的PBS重懸，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。S1P及相應(yīng)的化合物采用甲醇沉淀抽提?；旌弦簻u旋10 min后，4℃，12 000r／min離心5min，然后上清液轉(zhuǎn)移至一干凈的玻璃自動(dòng)上樣瓶中。每次進(jìn)樣10μL進(jìn)行LC－MS／MS分析。

2 結(jié) 果

2.1 STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎損傷 如表1所示，實(shí)驗(yàn)12周結(jié)束時(shí)，與正常對(duì)照組比較，糖尿病組大鼠的空腹血糖值顯著升高（P＜0.01），糖尿病大鼠的腎重／體質(zhì)量比與正常對(duì)照組比較顯著增加（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)糖尿病大鼠的24h尿蛋白明顯增高（P＜0.05）。糖尿病大鼠的腎小球損傷表現(xiàn)為腎小球肥大和腎小球系膜細(xì)胞外基質(zhì)積聚。與正常對(duì)照組相比，STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠12周后出現(xiàn)明顯的腎小球面積和系膜基質(zhì)面積增大；腎小球內(nèi)膜與腎小球囊發(fā)生粘連；并且PAS病理染色發(fā)現(xiàn)腎組織基質(zhì)成分明顯增多（圖1），提示糖尿病大鼠12周后出現(xiàn)明顯的腎臟肥大，腎小球硬化和腎功能受損。

2.2 糖尿病大鼠腎臟SphK1－S1P信號(hào)通路被激活 為了觀察糖尿病狀態(tài)下大鼠腎組織SphK1－S1P信號(hào)通路的變化，檢測(cè)了正常對(duì)照組和糖尿病模型組大鼠腎組織的SphK1的表達(dá)及活性和S1P水平。采用Real－time PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，糖尿病組大鼠腎臟SphK1mRNA水平是對(duì)照組的3倍，而SphK2mRNA水平?jīng)]有變化（圖2）。此外，免疫組織化學(xué)和Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠腎臟SphK1蛋白表達(dá)也有顯著升高（圖3）。LC－MS／MS實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，糖尿病大鼠腎臟SphK1活性顯著增加（圖4A）；并且S1P水平顯著增加（圖4B）。結(jié)果顯示糖尿病狀態(tài)下大鼠腎組織SphK1－S1P信號(hào)通路處于激活狀態(tài)，與作者已報(bào)道的糖尿病小鼠模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致［9］。糖尿病大小鼠模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果均提示SphK1－S1P信號(hào)通路的激活可能參與了糖尿病腎損害的病理進(jìn)程。

圖1 STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎臟系膜區(qū)基質(zhì)分泌情況（PAS，×200）

圖2 Real－time PCR檢測(cè)糖尿病大鼠腎臟SphK1和SphK2mRNA水平

圖3 SphK1在糖尿病腎臟組織中的表達(dá)

表1 血糖及腎功能指標(biāo)檢測(cè)

表1 血糖及腎功能指標(biāo)檢測(cè)

a：P＜0.05，b：P＜0.01，與對(duì)照組比較。

組別 血糖（mmol／L） 腎重／體質(zhì)量（mg／g） 尿蛋白（mg／24h）對(duì)照組5.30±0.16 6.17±0.21 2.09±0.15糖尿病組 23.56±2.27b 18.23±0.72a 13.15±1.12a

圖4 液質(zhì)聯(lián)用（LC－MS／MS）分別檢測(cè)SphK1活性和S1P含量

3 討 論

研究表明長(zhǎng)期高血糖、糖基化終產(chǎn)物、氧化應(yīng)激等可激活SphK1，進(jìn)而導(dǎo)致S1P的生成增加［10］，促進(jìn)腎小球系膜細(xì)胞增殖［11］等。腎臟纖維化是糖尿病腎病的主要病理特征之一，GMC是腎小球的主要功能細(xì)胞，無論在腎臟的生理功能還是病理變化中均發(fā)揮著重要的作用；現(xiàn)已認(rèn)為GMC參與了糖尿病腎病、腎小球硬化的損傷過程［12］。糖尿病狀態(tài)下，腎小球系膜細(xì)胞中細(xì)胞外基質(zhì)的積聚，促進(jìn)了腎臟纖維化的病理進(jìn)程［13］。

本研究觀察到糖尿病大鼠腎臟在SphK1－S1P信號(hào)通路的激活。本實(shí)驗(yàn)采用STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型觀察到SphK1－S1P信號(hào)通路與糖尿病腎病存在密切相關(guān)性。研究報(bào)道，在STZ誘導(dǎo)的大鼠4～5h后，其腎小球系膜細(xì)胞發(fā)生增殖，與此同時(shí)，SphK－S1P信號(hào)通路被激活［14－15］。并且，作者前期研究發(fā)現(xiàn)，在四氧嘧啶誘導(dǎo)12周的糖尿病小鼠，腎實(shí)質(zhì)與腎功能明顯受損，腎臟存在SphK－S1P信號(hào)通路的激活［9］。在本研究中，采用STZ誘導(dǎo)的12周糖尿病大鼠，腎臟亦明顯損害，腎臟SphK1－S1P信號(hào)通路被激活。研究結(jié)果進(jìn)一步提示，SphK1－S1P信號(hào)通路被體內(nèi)高血糖激活后，可能參與了糖尿病腎損傷的病理進(jìn)程。

綜上所述，作者通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)SphK1－S1P信號(hào)通路的激活可能參與了糖尿病腎損傷的病理進(jìn)程。SphK1－S1P信號(hào)通路如何影響糖尿病腎病的進(jìn)程有待進(jìn)一步研究證明。本研究為進(jìn)一步探明糖尿病腎病的病變機(jī)制、探索將SphK1－S1P信號(hào)通路作為抗糖尿病腎病的新的作用靶點(diǎn)提供了一定客觀依據(jù)。

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