張曉霞，王曉曦，段海峰，陳光輝解放軍總醫(yī)院 心內(nèi)科，北京 0085；總政治部機關醫(yī)院 心內(nèi)科，北京 000；軍事醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所，北京 00850

冠狀動脈粥樣硬化疾病是缺血性心臟病的首要原因，隨著介入治療及外科手術等冠脈血運重建技術的發(fā)展，缺血性心臟病患者的生存率有了很大提高，然而幸存者有相當一部分發(fā)展為充血性心力衰竭，心臟功能受到很大限制，生活質量低下[1]。由于心肌細胞再生能力極低，心肌缺血引起的心肌不可逆性損失成為缺血性心臟病治療中面臨的最大挑戰(zhàn)。近年來，干細胞研究成為心臟再生醫(yī)學的重要方向，動物實驗和臨床前期研究都顯示出了令人鼓舞的結果，多種干細胞都被證實具有減少心肌凋亡、改善心肌供血、提高心臟功能的作用[2-3]。其中，間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)由于其高分化潛能、低免疫源性、易于制備等特性被廣泛應用[4]。人臍帶華通膠間充質干細胞(Wharton's jelly mesenchymal stem cells，WJ-MSCs)來源于臍帶中的特殊胚胎黏膜結締組織，采集方便，對供體沒有傷害，不涉及倫理問題，在體外比骨髓MSCs有更強的擴增能力和更快的生長速度，因此是干細胞治療的理想來源[5]。本實驗對缺血性心臟病心功能不全患者進行了WJ-MSCs經(jīng)冠脈移植治療并進行隨訪，觀察其臨床治療的安全性和有效性。

資料和方法

1 患者資料 選擇解放軍總醫(yī)院2010年12月-2012年1月住院的缺血性心臟病心功能不全患者30例，其中男性25例，女性5例；年齡40~80歲，平均(60.5±3.7)歲；病程1~5年，平均病程2年。均經(jīng)冠狀動脈造影均確診為冠心病(含單支、雙支、多支病變)，超聲心動圖顯示左室射血分數(shù)＜50%；心功能(NYHA)分級Ⅱ~Ⅳ級，有胸悶、氣急、日?；顒虞p到中度受限、下肢水腫或夜間陣發(fā)性呼吸困難等癥狀。其中陳舊性心肌梗死13例，既往植入1~3枚支架21例，既往行冠狀動脈搭橋術2例，合并高血壓病14例，合并糖尿病8例。除外結構性心臟病、瓣膜性心臟病、頑固性高血壓(血壓控制不穩(wěn)定)、嚴重肝腎功能不全、活動性消化道出血、惡性腫瘤、深靜脈血栓及合并感染者。將患者隨機分為治療組與對照組各15例，兩組患者年齡、性別、基礎心臟病、心功能分級、肝腎功能及血脂等方面差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，患者本人及檢查、治療醫(yī)師對患者分組情況不知曉。所有患者都按目前冠心病治療指南接受系統(tǒng)藥物治療，并遵循標準的康復計劃。本實驗經(jīng)倫理委員會批準，治療均經(jīng)患者同意并已簽訂知情同意書。

2 細胞制備 經(jīng)父母同意后取得出生后新鮮嬰兒臍帶，具體制備步驟見文獻[6]。去除臍動靜脈后殘余組織剪碎成0.5~1.5 mm的組織塊，加入Ⅱ型膠原酶(2 mg/ml)置37℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱振蕩消化3~4 h，70 μm濾網(wǎng)過濾。將細胞懸液在4 ℃、2 000 r/min離心30 min后洗滌，重懸于完全培養(yǎng)液中。以1×104/cm2密度將細胞接種于培養(yǎng)基中，置37 ℃、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。72 h后去除非貼壁細胞，每隔3~4 d換液。細胞融合至80%加入胰酶消化傳代。流式細胞儀檢測CD14、CD31、CD34、CD45、CD73、CD90、CD105和HLA-DR的表達，行WJ-MSCs體外誘導分化實驗鑒別細胞特性。所有實驗應用第3~5代細胞進行。

3 細胞移植 所有患者均在治療開始前接受阿司匹林和抗凝肝素(0.7 U/kg)。常規(guī)穿刺右橈動脈行冠狀動脈造影(穿刺不成功者改用股動脈)，對有意義病變進行血運重建；選擇既往梗死相關動脈或心臟供血優(yōu)勢動脈，將微導管置入該動脈中遠段，分5次緩慢注入10 ml干細胞懸液(細胞數(shù)2×107)或0.9%氯化鈉注射液，即刻復查冠狀動脈造影觀察有無冠脈血流變化。治療過程中嚴密觀察患者臨床癥狀、生命體征及心電圖變化。

4 療效評價 患者治療前檢查血尿常規(guī)、血糖、血脂、肝腎功能、心肌酶、電解質、腫瘤標記物、心電圖、超聲心動圖，采用SF-36健康調(diào)查量表評價生活質量，包括身體功能、運動限制和總體健康評分[7]。由2位有經(jīng)驗的心臟超聲醫(yī)師共同評定超聲心功能(Siemens Acuson彩色多普勒超聲診斷儀)。干細胞移植后3 d復查心電圖與實驗室指標，術后3月、6月復查實驗室指標、心電圖、超聲心動圖、SF-36健康量表。治療及隨訪中記錄患者有無死亡、心肌梗死、嚴重心律失常、再血管化、心衰加重再住院、心絞痛再住院、腦梗死、新生腫瘤等嚴重不良臨床事件。

5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以-x±s表示，計數(shù)資料采用χ2檢驗比較兩組臨床事件發(fā)生率；采用重復測量的方差分析進行治療前后及組間臨床資料比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 細胞特性 流式細胞儀分析表明，所得細胞表達間充質干細胞特異性抗原CD73、CD90、CD105，而不表達造血和內(nèi)皮細胞表面標志(CD14、CD31、CD34和CD45)，移植免疫排斥反應相關表面標志物(HLA-DR)陰性。WJ-MSCs在體外能夠分化為肌細胞、骨細胞和軟骨細胞。

2 療效 所有患者冠狀動脈細胞輸注成功，沒有引起冠脈血流量變化，治療時和術后在院期間耐受性良好，無心絞痛發(fā)作，無心衰新發(fā)或加重，無發(fā)熱和過敏反應。術后隨訪6個月內(nèi)，治療組1例出院1月后因勞累誘發(fā)心衰加重再住院，對照組1例術后2月因心絞痛發(fā)作再住院，均藥物治療后緩解，余患者無嚴重不良臨床事件發(fā)生，兩組差異無統(tǒng)計學意義(表1)。二組治療前后血尿常規(guī)、肝腎功、心肌酶、腫瘤標記物水平無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。

3 兩組超聲心動圖比較 治療組術后3月及6月左室舒張末容量(LVEDV)和左室收縮末容量(LVE SV)均較術前顯著減小(P＜0.05)，左室射血分數(shù)(LV EF)術后3月及6月較術前提高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。對照組LVEDV、LVESV及LVEF變化無統(tǒng)計學意義。組間差異比較雖無統(tǒng)計學意義，但治療組較對照組LVEF有明顯上升趨勢(表2)。

4 兩組SF-36健康量表評分比較 治療組與對照組術后3月、6月較治療前身體功能及總體健康評分均有顯著提高(P＜0.05)，治療組術后6月較術后3月評分改善仍有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。運動限制評分變化二組均不顯著。組間差異比較顯示總體健康評分二組差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，余評分差異無統(tǒng)計學意義(表3)。

表1 WJ-MSCs冠脈移植后6月兩組主要負性臨床事件比較Tab. 1 Main adverse clinical events 6 months after coronary WJ-MSC transplantation(n)

討 論

本研究表明冠心病心功能不全患者冠脈內(nèi)WJ-MSCs移植在目前是安全而有效的。在治療期間及之后6個月隨訪中沒有發(fā)現(xiàn)異體細胞移植引起的免疫排斥反應，未發(fā)現(xiàn)異位組織形成，兩組患者發(fā)生嚴重不良臨床事件差異無統(tǒng)計學意義。其長期安全性我們將在今后的隨訪中加以觀察。

既往研究發(fā)現(xiàn)增殖、分化能力強的胚胎干細胞和誘導多能干細胞可能具有的致瘤性是限制其臨床應用的重要因素[8]。動物實驗證明，通過對元代、早代和晚代WJ-MSCs核型的觀察，以及將超過實驗常用量很多的細胞移植到小鼠體內(nèi)后，在觀察期內(nèi)均未發(fā)現(xiàn)腫瘤組織形成[9]。本實驗在移植后6個月的隨訪中未發(fā)現(xiàn)異位組織形成，相關腫瘤標志物水平無明顯改變也與該結果相符合。

目前已有許多實驗證實同種干細胞移植可改善心臟功能、減少心梗面積，本實驗結果也驗證了這一點，顯示W(wǎng)J-MSCs冠脈內(nèi)移植對于患者心功能和生活質量有明顯改善。WJ-MSCs改善心肌功能的機制還不是很清楚，可能與以下機制相關。1)華通膠間充質干細胞(WJ-MSCs)來源于臍帶的黏膜結締組織，除了具有間充質干細胞的共同特性外，由于其在發(fā)育遷移過程中環(huán)繞在胚胎血島細胞周圍，還少量地表達與胚胎干細胞相近的干性基因標志和早期心肌轉錄因子，因此比起其他來源的成體干細胞具有更強的分化潛能[10]。2)旁分泌功能是干細胞移植發(fā)揮作用的重要途徑[11]。干細胞移植后釋放多種細胞因子，既可以影響干細胞小生境，改善其自身生存環(huán)境，又可以影響相鄰的實質和間質細胞在正常和病理條件下的生物學特性，提高細胞存活、促進血管新生，激活內(nèi)源性的修復和再生機制[12]。隨訪中我們發(fā)現(xiàn)，治療組4例合并糖尿病患者血糖均控制良好并伴不同程度藥物減量，1例術后半月脫離口服降糖藥(二甲雙胍、阿卡波糖)，糖化血紅蛋白術前8.8%，術后3月及6月分別為6.7%、6.8%。1例合并帕金森癥的患者治療后肢體靜止性震顫明顯減輕。我們分析可能與冠脈內(nèi)移植的WJ-MSCs隨血液循環(huán)歸巢于外周患處以及旁分泌生成的一系列細胞因子改善局部再生能力低下細胞(胰島B細胞、神經(jīng)細胞)的功能有關[13-14]。對此將在后續(xù)試驗中加以研究。

表2 WJ-MSCs冠脈移植前后兩組心功能比較Tab. 2 Cardiac function of two groups before and after coronary WJ-MSC transplantation(-x±s)

表3 WJ-MSCs冠脈移植前后兩組SF-36生活質量評分比較Tab. 3 Scores of SF-36 and quality of life in two groups before and after coronary WJ-MSC transplantation(-x±s)

本實驗存在病例數(shù)不夠多、隨訪時間不夠長的不足，將在下一階段的實驗中加以改進。雖然目前多數(shù)干細胞移植臨床試驗隨訪時間較短，對于其改善心功能的長期療效仍然存疑，但已有少量長期隨訪的結果顯示心功能不全患者冠脈內(nèi)移植干細胞后5年主要不良心血管事件(MACE)發(fā)生率較對照組顯著減少[15]。對于各種方案治療效果不佳的缺血性心臟病患者，干細胞冠脈內(nèi)移植將提供一種安全有效的治療選擇。

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