鄒 曉，司全金，蔡力力

解放軍總醫(yī)院，北京 100853 1南樓心血管一科；2南樓臨床檢驗(yàn)科

血脂代謝紊亂與動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的形成密切相關(guān)，研究顯示，血脂持續(xù)異常是促進(jìn)AS發(fā)生及發(fā)展的重要因素，但臨床中常常有部分患者既往存在血脂水平升高，但急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)發(fā)生時(shí)低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)反而處于較低水平，因此，粥樣斑塊的穩(wěn)定性是否與血脂水平波動(dòng)有關(guān)不得而知。該研究通過制造血脂波動(dòng)模型，觀察血脂水平顯著波動(dòng)與斑塊穩(wěn)定性之間的關(guān)系，進(jìn)一步探討血脂異常影響動(dòng)脈粥樣斑塊的方式及機(jī)制。

材料與方法

1 試劑及儀器 高脂、低脂及普通飼料(北京市科傲公司)，血脂及ELISA試劑盒(羅氏公司)；Thermo IEC CL40離心機(jī)(公司)，全自動(dòng)生化分析儀(Roche Hitachi917型(公司)，瑞典產(chǎn)LKB-Ⅲ型超薄切片機(jī)，OLYMPUS BX60型雙目顯微鏡。西門子公司SEQUOIA512型超聲儀，探頭頻率8~14 MHz。

2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 24只12周齡的健康雄性新西蘭大耳兔，體質(zhì)量2.0~2.5 kg，由本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(許可證編號(hào)：SCXK(京)2007-0003)，環(huán)境適應(yīng)飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為3組：空白組(A)6只，飼普通料；對(duì)照組(B)9只，持續(xù)以含1%膽固醇、3%豬油的高脂飼料飼養(yǎng)；血脂波動(dòng)組(C)9只，高脂飼料飼養(yǎng)至12周動(dòng)脈粥樣硬化模型成功建立后，與低脂飼料每隔3周交替喂養(yǎng)1次，即12周換低脂飼料、15周換高脂飼料、18周換低脂飼料、21周換高脂飼料[1]。3組動(dòng)物飼料120 g/d，自由飲水，共喂養(yǎng)24周。實(shí)驗(yàn)過程中因腹瀉及不明原因死亡4只，剩余20只納入有效樣本統(tǒng)計(jì)分析。

3 血清生化檢測(cè)及主動(dòng)脈超聲檢測(cè) A、B兩組于0、12、24周末、C組于0、12、15、18、21、24周末經(jīng)兔耳緣靜脈空腹采血，血清總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、LDL-C檢測(cè)采用羅氏公司試劑在本院生化室用免疫比濁法完成，ELISA法測(cè)血清超敏C反應(yīng)蛋白(high-sensitivity C-reactive protein，hs-CRP)水平。根據(jù)血脂原始參數(shù)計(jì)算血脂平穩(wěn)度，以血脂平穩(wěn)指數(shù)(smoothness index，SI)表示，SI=-x/s(-x與s分別指12~24周5次采血各血脂水平的均值與標(biāo)準(zhǔn)差)，SI值越高說明血脂平穩(wěn)度越好，反之則說明血脂水平波動(dòng)大。應(yīng)用超聲儀于實(shí)驗(yàn)開始、12周末及24周末行腹主動(dòng)脈超聲檢測(cè)。

4 病理形態(tài)學(xué)觀察 24周末處死動(dòng)物，取主動(dòng)脈剝離外膜脂肪組織，縱行剖開置于多聚甲醛中固定保存。大體標(biāo)本行油紅染色后攝像，利用生物醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(Image-pro plus)測(cè)定斑塊面積和內(nèi)膜面積，計(jì)算斑塊與內(nèi)膜面積百分比。于主動(dòng)脈弓處取材，常規(guī)石蠟包埋，制成厚約5 μm橫截面切片，行蘇木素-伊紅(HE)染色，顯微鏡下觀察超微結(jié)構(gòu)。

5 數(shù)據(jù)處理 結(jié)果計(jì)算均采用-x±s表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS13.0軟件分析。計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)和方差分析。

結(jié) 果

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般情況 實(shí)驗(yàn)過程中A組不明原因死亡2只，B、C組因腹瀉各死亡1只，最終剩余20只動(dòng)物資料納入統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。喂養(yǎng)24周后，各組動(dòng)物體重均較喂養(yǎng)前顯著增加(P＜0.01)，24周體重明顯大于12周(A組P＜0.05，余P＜0.01)，但各組之間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，見表1。

2 血脂參數(shù)、SI及血清hs-CRP變化 C組通過交替高低脂飼料，成功制作高低血脂波動(dòng)模型(圖1)。12周時(shí)，B組和C組動(dòng)物血清TC、LDL-C、hs-CRP水平均較0周及A組明顯升高，HDL-C則較0周及A組顯著降低(P＜0.01)；24周時(shí)，C組血清TC、LDL-C水平明顯低于B組(P＜0.05)，血清hs-CRP水平明顯高于12周水平及B組(P＜0.01)。24周時(shí)，B、C組SI均低于A組，C組TC與LDL-C SI值低于B組的12.51，見表1。

表1 三組體重、SI、血脂及hs-CRP比較Tab. 1 Weight, SI and serum lipid and hs-CRP level in 3 groups

圖 1 C組不同周數(shù)血脂水平Fig. 1 Lipid level in group C at different weeks

3 主動(dòng)脈超聲 造模前3組兔腹主動(dòng)脈均內(nèi)壁光滑，內(nèi)膜不易顯示，管壁無(wú)隆起、增厚、斑塊形成。高脂喂養(yǎng)后，動(dòng)脈管壁表現(xiàn)內(nèi)-中膜厚度(intima-media thickness，IMT)增厚，局部隆起甚至多發(fā)斑塊形成。0周時(shí)，各組動(dòng)物主動(dòng)脈IMT無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，飼養(yǎng)12周后，B、C組IMT明顯高于0周及空白對(duì)照組(P＜0.01)，且兩組血管內(nèi)可見明顯斑塊形成；24周時(shí)，C組IMT明顯高于其12周值(P＜0.05)，且高于B組(P＜0.01)，見表2。另外，同一血管部位斑塊不同周數(shù)比較，12周時(shí)B組斑塊(0.74×3.46) mm、C組(0.80×4.9) mm，24周時(shí)B組(0.75×4.34) mm、C組(1.40×9.90) mm，可見C組斑塊增長(zhǎng)速度明顯大于B組。

表2 三組不同周數(shù)IMT比較Tab.2 IMT in 3 groups at different weeks(mm)

圖 2 主動(dòng)脈粥樣硬化病變血管內(nèi)膜油紅染色Fig. 2 Oil red staining of atherosclerotic intima

圖 3 三組動(dòng)脈粥樣斑塊HE切片比較Fig. 3 HE staining of atherosclerotic plaque sections from 3 groups A: normal intima in group A(×200); B：structure of atherosclerostic plaque in group B (×100); C：structure of atherosclerostic plaque in group C (×200); D：revas-cularization in group C(×400)

4 動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積百分比 血管內(nèi)膜油紅染色顯示，動(dòng)脈粥樣硬化病變處被染成紅色(圖2)。C組斑塊面積百分比為(53.53±22.6)%，明顯較B組(33.90±24.91)%高(P＜0.05)。肉眼下可見A組主動(dòng)脈內(nèi)膜光滑，未被油紅著色，未見粥樣硬化斑塊；B組主動(dòng)脈內(nèi)膜有較嚴(yán)重的粥樣硬化病變，可見脂樣物質(zhì)突出管腔，呈點(diǎn)、斑、條狀隆起，邊緣清楚，表面無(wú)明顯破潰，較嚴(yán)重者斑塊融合成片，以主動(dòng)脈起始部為重；C組主動(dòng)脈內(nèi)膜有嚴(yán)重粥樣斑塊病變，密布內(nèi)膜面，主動(dòng)脈起始部嚴(yán)重，與B組相比斑塊邊緣不清楚，可見斑塊表面不光滑表現(xiàn)，降主動(dòng)脈病變較B組重。

5 HE染色切片 A組主動(dòng)脈內(nèi)膜光滑平整，可見排列整齊的內(nèi)皮細(xì)胞，內(nèi)膜未見泡沫細(xì)胞及脂質(zhì)沉積；B組動(dòng)脈可見明顯動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，血管內(nèi)膜明顯增厚，內(nèi)皮細(xì)胞脫落，管壁內(nèi)見泡沫細(xì)胞形成，內(nèi)膜下及斑塊內(nèi)有膽固醇結(jié)晶體形成，部分區(qū)域可見壞死及鈣鹽沉積；C組亦可見明顯粥樣斑塊形成，與B組相比，斑塊較厚但纖維帽較薄、脂核較大，部分斑塊可見纖維帽被溶解征象，管壁內(nèi)可見大量泡沫細(xì)胞及炎性細(xì)胞，斑塊內(nèi)可見新生血管形成(圖3)。顯微鏡下主動(dòng)脈弓處斑塊及纖維帽厚度比較，C組斑塊厚度(800.38±98.25) μm明顯大于B組(675.00±109.67) μm(P＜0.05)，但纖維帽厚度(103.50±45.66) μm小于B組(295.83±97.90) μm(P＜0.01)。

討 論

ACS的主要病理機(jī)制是不穩(wěn)定的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂及血栓形成，因此發(fā)現(xiàn)影響斑塊進(jìn)展速度的因素及預(yù)測(cè)動(dòng)脈粥樣斑塊的穩(wěn)定性具有十分重要的臨床指導(dǎo)意義。影響穩(wěn)定斑塊進(jìn)展為易損斑塊的相關(guān)因素主要包括斑塊自身結(jié)構(gòu)即“大脂核”特征薄纖維帽、血管內(nèi)皮功能異常、高膽固醇血癥以及炎癥反應(yīng)等[2-5]；且發(fā)現(xiàn)血清標(biāo)記物如MMP-9、IL-18等可以預(yù)測(cè)易損斑塊[6-7]。眾所周知導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的罪魁禍?zhǔn)资歉咚降腖DL-C，其通過氧化修飾成為ox-LDL，ox-LDL在動(dòng)脈斑塊的早期形成和后期進(jìn)展中均發(fā)揮重要生物學(xué)效應(yīng)，包括損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞、表達(dá)黏附分子、聚集白細(xì)胞以及形成泡沫細(xì)胞，其增加可導(dǎo)致粥樣斑塊由穩(wěn)定向不穩(wěn)定的易損斑塊轉(zhuǎn)化[8]。然而臨床工作中，部分ACS患者發(fā)病時(shí)卻表現(xiàn)出較低水平的LDL-C，由此推測(cè)血脂平穩(wěn)度在斑塊的進(jìn)展中可能起到一定的作用。

本研究結(jié)果顯示：血脂波動(dòng)組TC、LDL-C的SI值分別為3.60、3.29，明顯低于對(duì)照組的12.51、7.61。飼養(yǎng)12周后，與空白組及基礎(chǔ)值相比，對(duì)照組和血脂波動(dòng)組血清TC、TG、LDL-C及hs-CRP水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；24周后，與對(duì)照組相比，血脂波動(dòng)組hs-CRP水平明顯升高。血脂波動(dòng)組不同周數(shù)腹主動(dòng)脈超聲示血管內(nèi)中膜厚度明顯高于對(duì)照組，超聲下24周與12周斑塊大小比較可見血脂波動(dòng)組進(jìn)展速度較對(duì)照組快。主動(dòng)脈形態(tài)學(xué)變化方面，對(duì)照組及血脂波動(dòng)組主動(dòng)脈內(nèi)壁肉眼及光鏡下均可見典型動(dòng)脈粥樣斑塊，血脂波動(dòng)組斑塊面積百分比較對(duì)照組升高，但斑塊纖維帽厚度較對(duì)照組薄(肩部明顯)。另外，血脂波動(dòng)組斑塊纖維帽周圍有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，部分區(qū)域可見新生血管及明顯纖維帽不連續(xù)現(xiàn)象。本研究結(jié)果證實(shí)，血脂平穩(wěn)度對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的進(jìn)展速度有所影響，且SI越小即血脂波動(dòng)越大，斑塊的發(fā)展速度越快。原因可能為炎癥反應(yīng)貫穿動(dòng)脈粥樣硬化斑塊發(fā)生和進(jìn)展的全過程，既往亦有文獻(xiàn)證實(shí)hs-CRP與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊進(jìn)展明顯相關(guān)[9-11]。而本研究中血脂波動(dòng)組hs-CRP水平較高，且切片中可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，可推測(cè)不平穩(wěn)的血脂水平造成斑塊內(nèi)炎癥反應(yīng)增加，而加劇的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致動(dòng)脈斑塊進(jìn)展速度加快。但是血脂水平波動(dòng)究竟是通過何種機(jī)制導(dǎo)致血管內(nèi)炎癥反應(yīng)增加，仍需進(jìn)一步研究。

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