李云奇，肖 毅，董金凱，王 偉，田仁禮，殷小濤，林曉亮，于繼云，高江平解放軍總醫(yī)院 泌尿外科，北京 10085；軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850；解放軍第07醫(yī)院 泌尿外科，北京 100071

腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma，RCC)是腎臟惡性程度較高的腫瘤之一，也是泌尿系常見的腫瘤。過去30年中腎細(xì)胞癌的發(fā)病率逐年上升[1-3]。病人確診時(shí)已經(jīng)到了晚期，同時(shí)在行根治性切除術(shù)后的腎癌中也有20%~30%會發(fā)生轉(zhuǎn)移，對于失去手術(shù)機(jī)會的RCC目前還沒有令人滿意的治療方法[4-5]。因?yàn)樗拿庖咴院芨?，對放化療都不敏感，所以免疫治療的方法作為一種新的治療手段被給予了厚望，成為研究熱點(diǎn)[6-8]。

本實(shí)驗(yàn)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出人RCC細(xì)胞上一種膜表達(dá)抗原G250的全長基因，根據(jù)DNA重組技術(shù)將其定向插入到pIRES-neo真核表達(dá)載體中。通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，導(dǎo)入renca細(xì)胞中，經(jīng)過G418的加壓，建立可以穩(wěn)定表達(dá)人G250基因的小鼠renca細(xì)胞株，為后續(xù)腎癌疫苗的免疫應(yīng)答奠定了基礎(chǔ)。

材料和方法

1 主要材料及試劑 大腸埃希菌DH5α和小鼠renca細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存，pIRES-neo真核表達(dá)載體購自Clontech公司，T4DNA連接酶，高保真PyrobestTMExTaq聚合酶是TaKaRa公司的產(chǎn)品，G418，PCR所用的酶及dNTP購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，RT-PCR是toyobo公司產(chǎn)品，兔抗人一抗購自Santa cruz公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記的二抗購自北京中橋技術(shù)有限公司，細(xì)胞培養(yǎng)用的RPMI1640來自Thermo公司，胎牛血清來自Hyclone公司，研究所用引物由Invitrogen公司合成，lipofectamine TM2000購自Invitrogen公司。轉(zhuǎn)染用小提試劑盒是北京天根生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，凝膠回收試劑盒，質(zhì)?；厥赵噭┖袨楸本┤┻h(yuǎn)志產(chǎn)品。

2 人G250基因的擴(kuò)增 以我們實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的含有G250基因載體的質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增G250基因。反應(yīng)體系參照EXTaq酶的說明書，50 μl，反應(yīng)條件是95 ℃，預(yù)變性6 min，94 ℃變性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，共擴(kuò)增出32個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸7 min。擴(kuò)增引物，上游引物：GCAATTG CAGAGGTTGCCGGATGCAG；下游引物：GAGATC TCTAGGCTAGTCTCGGCTAC。引物是由Invitrogen生物技術(shù)有限公司合成。

3 人G250真核表達(dá)載體的構(gòu)建 首先將PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收純化，和pIRES-neo真核表達(dá)載體質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳分離、回收純化，T4DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌DH5α，挑出陽性克隆進(jìn)行雙酶切和PCR鑒定，將分析正確的陽性克隆質(zhì)粒進(jìn)行保存，并且命名為pIRES-neo-G250。

4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及克隆篩選 首先做預(yù)實(shí)驗(yàn)，以10 d殺死全部未轉(zhuǎn)染renca細(xì)胞G418的最低濃度為最終篩選濃度，結(jié)果確定實(shí)驗(yàn)G418篩選濃度為600 mg/L。在轉(zhuǎn)染的前1 d，取對數(shù)生長期的renca細(xì)胞，用胰酶消化后接種于六孔板中，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到60%~70%時(shí)，將提取的轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pIRES-neo-G250和空載體pIRES-neo在LipofectamineTM2000的介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染入renca細(xì)胞，方法按照LipofectamineTM 2000說明書。在48 h之后，將六孔板中細(xì)胞用胰酶消化，以1∶3的比例傳代，56 h后，按每瓶600 mg/L終濃度加入G418。約7 d，細(xì)胞出現(xiàn)大量死亡，此時(shí)每隔1 d換1次液，持續(xù)加壓到細(xì)胞不再死亡且以團(tuán)簇生長為止。

5 Western blotting檢測G250蛋白表達(dá) 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白質(zhì)變性加熱后，10%的SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，50 g/L脫脂奶粉Tris鹽溶液室溫震蕩封閉2 h。1∶500稀釋的人G250抗體作為一抗，1∶2 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG作為二抗，分別孵育后進(jìn)行顯影定影。

6 流式細(xì)胞儀和激光掃描共聚焦顯微鏡檢測 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，用預(yù)冷的含2%的新生牛血清的PBS清洗細(xì)胞3次，實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞同時(shí)用兔抗人的一抗4 ℃孵育40 min，含2%的新生牛血清的PBS清洗細(xì)胞3次后，同時(shí)加入FITC標(biāo)記的二抗山羊抗兔IgG，4 ℃孵育40 min，2%的新生牛血清的PBS清洗細(xì)胞3次后，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測，將檢測后的renca細(xì)胞進(jìn)行滴片后激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

結(jié) 果

1 人G250真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 重組真核表達(dá)質(zhì)粒pIRES-neo -G250用EcoRI和BamHI雙酶切后呈現(xiàn)約1 100 bp和5 500 bp左右的兩條目條帶，與預(yù)期大小一致。將鑒定正確的質(zhì)粒送到Invitrogen生物技術(shù)有限公司測序，結(jié)果與當(dāng)初預(yù)計(jì)的基因序列完全相同，說明構(gòu)建的質(zhì)粒正確。見圖1。

圖 1 pIRES-neo-G250酶切電泳圖M： DL2000標(biāo)志物； 1： pIRES-neo質(zhì)粒； 2： 酶切后質(zhì)粒Fig. 1 Enzyme digestion electrophoresis of pIRES-neo-G250 M：DL 2000 maker; lane 1：pIRES-neo plasmid; lane 2： products after restriction enzyme digestion(EcoRI/BamHI)

圖 2 Western blotting檢測結(jié)果 1：轉(zhuǎn)染pIRES-neo -G250；2： 轉(zhuǎn)染pIRES-neoFig. 2 Western blotting showing pIRES-neo-G250 in experiment group (1) and pIRES-neo in control group (2)

2 Western blotting檢測G250蛋白表達(dá) 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pIRES-neo-G250的renca細(xì)胞能夠檢測到G250的蛋白條帶，而對照組則沒有相應(yīng)的條帶，用GADPH作為內(nèi)參，與預(yù)期一致。見圖2。

圖 3 流式細(xì)胞圖分析 A： 轉(zhuǎn)染pIRES-neo； B： 轉(zhuǎn)染pIRES-neo -G250Fig. 3 Flow cytometry showing pIRES-neo and pIRES-neo-G250 in control group (A) and experiment group (B)

圖 4 激光共聚焦檢測 A，B： 轉(zhuǎn)染pIRES-neo； CD： 轉(zhuǎn)染pIRES-neo -G250； AC： 熒光圖； BD： 明場圖Fig. 4 Immunofluorescence confocal assay showing pIRES-neo in control group (A, B) and pIRES-neo-G250 in experiment group (C, D)

3 Renca細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)和激光共聚焦檢測流式細(xì)胞術(shù)(圖3)和激光共聚焦顯微鏡(圖4)檢測結(jié)果顯示，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pIRES-neo-G250的renca細(xì)胞用特異性抗體檢測得到了高效的熒光表達(dá)，而對照組則沒有。

討 論

G250是一種膜表達(dá)抗原，它與具有碳酸酐酶活性的細(xì)胞黏附因子-碳酸酐酶9(MN/CA IX)的基因結(jié)構(gòu)完全相同，因此命名為G250- MN/CA IX，簡稱G250。它是碳酸酐酶家族成員之一，基因位于染色體9p12-13上[9-10]。因?yàn)樗磉_(dá)與腎透明細(xì)胞癌(renal cell carcinoma，RCC)細(xì)胞上的跨膜抗原表位，可以與G250抗體結(jié)合，顯示有大多數(shù)的腎透明細(xì)胞癌和其他類型的腎透明細(xì)胞癌都有G250的表達(dá)，而在正常組織中很少或根本不表達(dá)[11-12]。所以它在RCC細(xì)胞中的這種特性使它成為腫瘤疫苗潛在的靶抗原和腫瘤治療的重要靶位[13-14]。G418是一種氨基糖苷類抗生素，它通過抑制轉(zhuǎn)座子Tn601，Tn5的基因，干擾核糖體功能而阻斷蛋白質(zhì)合成，對原核和真核等細(xì)胞產(chǎn)生毒素。當(dāng)neo基因被整合進(jìn)真核細(xì)胞DNA后，則能啟動(dòng)neo基因編碼的序列轉(zhuǎn)錄為mRNA，從而獲得抗性產(chǎn)物氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶的高效表達(dá)，使細(xì)胞獲得抗性而能在含有G418的選擇性培養(yǎng)基中生長，大大降低了篩選的時(shí)間[15-16]。

為了驗(yàn)證此細(xì)胞株穩(wěn)定表達(dá)G250的能力，筆者又對其反復(fù)凍存和復(fù)蘇以及連續(xù)傳代后的細(xì)胞進(jìn)行了檢測，能夠達(dá)到預(yù)期目標(biāo)。綜上所述，我們成功構(gòu)建了pIRES-neo-G250真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染及篩選了穩(wěn)定表達(dá)G250的細(xì)胞株。為進(jìn)一步研究以人G250為靶抗原構(gòu)建的腎癌基因疫苗提供了很好的細(xì)胞株，同時(shí)也為G250在腎癌免疫治療中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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