李鳳偉,劉 娟,王 超

(佳木斯大學(xué)藥學(xué)院,黑龍江 佳木斯 154007)

黑龍江林蛙(Rana amurensis Boulenger),又名哈士蟆、臭迷子、雪蛤。隸屬兩棲綱 Amphibia,無尾目 Anura,參差型亞目 Diplasiocoela,蛙科 Ranidae,蛙亞科 Raninae,林蛙屬Rana[1]。大多數(shù)標(biāo)本上眼瞼有一黑斑,從兩眼之間至肛門上方有一條寬闊的灰白色或灰色略帶藍(lán)色的脊中線,鼓膜部位有三角形黑色斑[2]。

近年來對(duì)黑龍江林蛙的研究主要集中在養(yǎng)殖、食用、物種保護(hù)以及環(huán)境污染等方面,而從藥用角度對(duì)黑龍江林蛙的研究較少[3～6]。超聲技術(shù)是近年來普遍用于中藥材有效成分提取的方法[7],它能夠加速目標(biāo)成分進(jìn)入溶劑,從而很大程度的提高了提取效率,節(jié)約了溶劑。本文首次采用超聲法對(duì)黑龍江林蛙卵中多糖的提取工藝進(jìn)行研究,考察超聲波在黑龍江林蛙卵多糖的提取中應(yīng)用的可行性,為建立快速、經(jīng)濟(jì)、高效的黑龍江林蛙卵多糖提取方法提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù),為后續(xù)黑龍江林蛙卵多糖的進(jìn)一步開發(fā)提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與儀器

黑龍江林蛙9月份捕捉于佳木斯地區(qū),經(jīng)佳木斯大學(xué)生藥學(xué)教研室劉娟教授鑒定為蛙科林蛙屬黑龍江林蛙,黑龍江林蛙及卵標(biāo)本保存于佳木斯大學(xué)生藥學(xué)研究室。將蛙解剖,卵取出后陰干,粉碎后密封保存。

HH-2.4型恒溫水浴鍋(鄭州長城科工貿(mào)有限公司),KQ5200型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司),SHB-Ⅲ循環(huán)水式真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司),電子天平(上海恒平科學(xué)儀器有限公司),紫外-可見分光光度計(jì) (上海棱光技術(shù)有限公司),80-2型離心機(jī)(上海浦東物理光學(xué)儀器廠)。

苯酚,濃硫酸,石油醚,無水乙醇,氯仿,正丁醇等試劑均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 多糖提取工藝流程

黑龍江林蛙卵粉末→石油醚回流6h,除去脂溶性雜質(zhì)→按比例加入蒸餾水,熱水浴一定時(shí)間→超聲 (超聲功率160W)→抽濾→取濾液,加入 1倍量的無水乙醇沉淀過夜→3000r/min離心 15min→蒸餾水溶解沉淀 ,定容至 50mL容量瓶中→Sevage試劑除蛋白→得多糖溶液。

2.2 黑龍江林蛙卵多糖含量的檢測方法

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作[8]

取 105℃干燥至恒重的葡萄糖 10mg,加水溶解,定容至100mL容量瓶中,配成濃度為0.1mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別從葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液中準(zhǔn)確移取 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7mL置于干燥的試管中 ,分別加水補(bǔ)至各溶液總量為2.0mL,再加入1.0mL 5%的苯酚溶液,搖勻 ,然后迅速加入5.0mL的濃硫酸,充分混勻 ,室溫冷卻15min后 ,40℃水浴10min,取出流水冷卻。以加入2.0mL蒸餾水的溶液作為空白,在490nm波長處測定吸光度值。以葡萄糖含量(μ g)為橫坐標(biāo),吸光度(A)為縱坐標(biāo),繪制吸光度-葡萄糖含量的關(guān)系曲線,見圖1。

圖1 葡萄糖

2.2.2 樣品多糖的含量測定

取多糖溶液2.0mL加入1.0mL5%的苯酚溶液,搖勻,再迅速加入5.0mL的濃硫酸,充分混勻,室溫冷卻15min后,40℃水浴10min,取出流水冷卻。以加入2.0mL蒸餾水的溶液作為空白,在490nm波長處測定吸光度值,以標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算,再乘以校正系數(shù)0.9得黑龍江林蛙卵多糖的含量。

2.3 黑龍江林蛙卵多糖提取工藝的單因素實(shí)驗(yàn)

黑龍江林蛙卵多糖提取工藝的四個(gè)因素:超聲時(shí)間、料液比、超聲前加熱時(shí)間、超聲溫度。各因素的水平分別為:超聲 時(shí) 間:10、 20、30、 40、 50min;料 液 比:1:10、 1:20、 1:30、1:40、1:50;超聲前加熱時(shí)間:10、 20、 30、40、 50min;超聲 溫度:58、68、78、 88、98℃。每個(gè)因子設(shè)計(jì) 3個(gè)重復(fù)性實(shí)驗(yàn) ,取平均值作為實(shí)驗(yàn)參數(shù),確定各因素對(duì)多糖含量的影響。

2.4 黑龍江林蛙卵多糖提取工藝的正交實(shí)驗(yàn)

以多糖含量為指標(biāo),在上述單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選擇超聲時(shí)間 (A)、料液比 (B)、超聲前加熱時(shí)間 (C)、超聲溫度(D)四個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn),采用 L9(34)正交試驗(yàn)表進(jìn)行實(shí)驗(yàn),各因素水平見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

圖2 超聲時(shí)間對(duì)多醣含量的影響

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素實(shí)驗(yàn)

3.1.1 超聲時(shí)間對(duì)蛙卵多糖提取的影響

由圖2可知,隨著超聲時(shí)間的延長,蛙卵多糖的含量先升后降。10～20min時(shí)增加幅度最大,20min后多糖含量迅速下降。可能是由于隨著超聲時(shí)間的延長多糖的結(jié)構(gòu)被破壞,導(dǎo)致含量下降。超聲20min時(shí)達(dá)到最大,為625.7mg/100g。

3.1.2 料液比對(duì)蛙卵多糖提取的影響

由圖3可知,隨著料液比的增大 ,蛙卵多糖的含量總體呈上升趨勢(shì)?？赡苁怯捎陔S著料液比的增大,蛙卵細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的多糖濃度梯度增大,加快了多糖的溶出。當(dāng)料液比為1:50時(shí) ,多糖含量達(dá)到最大值,為217.7mg/100g。

圖3 料液比對(duì)多醣含量的影響

3.1.3 超聲前加熱時(shí)間對(duì)蛙卵多糖提取的影響

由圖 4可知 ,超聲前加熱時(shí)間在10～40min范圍時(shí),對(duì)多糖含量的影響不大,同時(shí)多糖含量也較低。在 40～50 min時(shí)多糖含量增加幅度較快,50min時(shí)達(dá)到最大,為122.3mg/100g。可能是由于多糖的溶出與蛙卵外包裹的膠狀物有關(guān),40min之前膠狀物的溶解較少,且也較慢,阻止了多糖的溶出,而在40min之后膠狀物的溶解加快,同時(shí)多糖的溶出量也迅速增加。

3.1.4 超聲溫度對(duì)蛙卵多糖提取的影響

由圖 5可知,多糖含量在超聲溫度為58～88℃范圍內(nèi)時(shí),呈下降的趨勢(shì);在 88～ 98℃范圍內(nèi),呈上升趨勢(shì),但升高幅度不大?？赡苁怯捎谠诔暡ㄖ卸嗵且追纸?溫度升高會(huì)加快多糖的分解速度,因此導(dǎo)致了超聲溫度升高多糖含量下降的問題。在超聲溫度為58℃時(shí)多糖含量最高,為 610.7mg/100g。

3.2 正交試驗(yàn)

由表2可知,各實(shí)驗(yàn)因素對(duì)黑龍江林蛙卵多糖含量影響的大小順序?yàn)?D＞B＞A＞ C,因此超聲溫度對(duì)蛙卵多糖含量的影響最大,其次是料液比和超聲時(shí)間,超聲前加熱時(shí)間影響較小。確定黑龍江林蛙卵多糖最佳提取工藝條件為A1B2C3D2,即超聲時(shí)間 10min,料液比1:40g/mL,超聲前加熱時(shí)間50min,超聲溫度68℃。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果與極差分析

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)為首次對(duì)未成熟的黑龍江林蛙卵中的粗多糖進(jìn)行研究,所采用的超聲法提取蛙卵粗多糖的最佳工藝參數(shù)為:超聲時(shí)間 10min,料液比1:40g/mL,超聲前加熱時(shí)間50min,超聲溫度68℃。該方法具有溶劑用量少,成本低;操作簡單方便;提取時(shí)間短,節(jié)能等優(yōu)點(diǎn)。應(yīng)用該方法,采用優(yōu)化的工藝條件可獲得純度較高的蛙卵多糖,為黑龍江林蛙卵多糖的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

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