陶 然,韓 旭,羅振國

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 佳木斯 154003)

前列腺癌(prostate cancer,PCa)在歐美國家尤其非洲裔黑人最常見;在亞洲及前蘇聯(lián)國家較少見。近年來,我國的經(jīng)濟(jì)增長迅速,前列腺癌的發(fā)病率增加。隨著我國社會(huì)逐漸進(jìn)入老年化,前列腺癌發(fā)病率必然加大。前列腺癌早期通常常沒有癥狀,只有當(dāng)腫瘤阻塞尿道,膀胱頸時(shí),發(fā)生類似下尿道梗阻或刺激癥狀。因此,前列腺癌的早期診斷尤為重要。小分子 RNA(miRN A)的發(fā)現(xiàn),為前列腺癌的研究帶來希望。研究證實(shí),人類的眾多生理、病理過程都與 miRN A有關(guān),包括前列腺癌的發(fā)生發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)中,作者選取 miRN A家族的miRNA-26a,用 RT-PCR法檢測前列腺癌患者(prostatic cancer,PCa)、良性前列腺增生 (benign prostatic hyperplasia,BPH)患者及正常人血清中 miRN A-26a的表達(dá) ,研究其在前列腺癌診斷中的臨床意義。

1 資料和方法

1.1 一般資料

收集佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院2011-03～2013-01門診收治的良性前列腺增生患者血清20例,前列腺癌患者血清20例 ,正常人血清20例。

1.2 主要儀器和試劑

(1)主要熒光分析設(shè)備:ABI7000熒光定量 PCR儀。(2)試劑盒(miRN A提取試劑);miRN A TM PARISTM Kit ABI生物公司;(Applied Biosystem p/n AM 1556)試劑盒 ABI生物公司;TaqMan MiRN A Assays Kit ABI生物公司;Taq-Man MiRN A RT Kit200rxns ABI生物公司;TaqManTM Universal PCR Master Mix2ABI生物公司。

1.3 引物和探針

miRNA-26a反轉(zhuǎn)錄引物、PCR引物和探針分別來自ABI生物公司 TaqMan MiRN A RT Kit.和 TaqMan MiRNA Assay Kit

miR-26a for CTGTCAACGATACGCTACPCR GTAATCCAGGATAGGCT G U6 for RT GAACGCTTCACGAAT TTGcmiR-26a for GCTGTCAACGAT ACGCTACCT AACGGCATGACAGT GTCAG RT

1.4 PSA檢測

由佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科完成,查閱病歷可獲得。

1.5 miRN A的提取、分離和 RT-PCR檢測

按照 ABI公司 miRNA提取試劑盒說明分離、提取 miRNA。嚴(yán)格按照試劑盒說明書方法步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,最終獲得血清 miRN A的反轉(zhuǎn)錄 cDN A產(chǎn)物。用上步反轉(zhuǎn)錄所得到的cDN A為模板,以 U6為內(nèi)參,按照 TaqMan MicroRN A RT Kit.和 TaqMan MiRNA Assay試劑盒說明書對(duì) miR-26a進(jìn)行 PCR反應(yīng)擴(kuò)增。數(shù)據(jù)分析:采用校正曲線法進(jìn)行分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS18.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)采用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差 (± s)表示,采用單因素方差分析,P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用 spearman雙變量相關(guān)性分析,P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

1)miR-26a在前列腺癌,前列腺增生患者和正常人血清中的表達(dá)情況

以 U6作為內(nèi)參檢測 miRNA-26a的表達(dá)水平,檢測系統(tǒng)為 ABI7000,通過系統(tǒng)檢測 ct值表示目的基因 mRNA的表達(dá)量。其表達(dá)的相對(duì)變化以2一 vvCt表示。擴(kuò)增曲線圖。見圖1。對(duì) miR-26a表達(dá)情況進(jìn)行分析,將它們分為前列腺癌血清組,增生血清組和正常人血清,采用單因素方差分析檢驗(yàn),P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。前列腺癌組患者血清中的 miRNA-26a水平明顯增高,前列腺癌血清組 ,前列腺增生血清組的表達(dá)量分別為正常人血清組的10.26±7.56,1.50±1.70。

圖1

2)前列腺癌患者 miR-26a表達(dá)與 Gleason分級(jí)評(píng)分和TPSA的相關(guān)性分析

前列腺癌患者血清中 miR-26a的表達(dá)與 Gleason存在著正相關(guān),P ＜0.05,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 ,相關(guān)系數(shù)為 0.682,用散點(diǎn)圖表示,與 TPSA評(píng)分無相關(guān)性,P＞ 0.05,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

microRN A(miRNA)是 RN A分子中一類大小為 18～25個(gè)核糖核苷酸(nt)的非編碼 RNA,它們通過與靶 mRN A互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合的方式調(diào)節(jié)基因表達(dá)。近幾年來 miRN A與腫瘤的關(guān)系得到了廣泛關(guān)注,有研究報(bào)道顯示,miRN A在多種腫瘤中表達(dá)發(fā)生改變,可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān),被認(rèn)為起到癌基因或抑癌基因的作用,針對(duì)此特性競爭抑制或啟動(dòng)microRN A的功能為解決前列腺癌的診斷和治療提供了可能性。

miR-26a是含有21個(gè)核苷酸(nt)的小分子 RN A,人類的大多數(shù)組織中都表達(dá)此類物質(zhì)。經(jīng)序列分析顯示,人類的miR-26a常位于3號(hào)染色體的3P21.3,這個(gè)染色體的位點(diǎn)是不穩(wěn)定的。本實(shí)驗(yàn)中,作者利用 QRT-PCR方法檢測前列腺癌患者血清中 miRN A-26a的表達(dá),良性前列腺增生患者及正常人為對(duì)照。結(jié)果顯示 miR-26a在前列腺癌患者血清中呈高表達(dá),并且與 Gleason存在著正相關(guān),與 TPSA評(píng)分無相關(guān)性。在前列腺癌患者血液中出現(xiàn)這種 miRNA特異性的原因,這要有以下兩種觀點(diǎn)。1)miRNA作為癌基因或者抑癌基因的角色,直接參與前列腺癌的細(xì)胞凋亡。2)miRN A與雄激素信號(hào)的關(guān)系密切。前列腺癌的發(fā)生發(fā)展受雄激素影響,治療進(jìn)展期前列腺癌的重要方法就是去勢治療,miRNA具有雄激素應(yīng)答功能,可與雄激素信號(hào)形成一個(gè)反饋回路,原理類似與人體的內(nèi)分泌系統(tǒng),但卻復(fù)雜很多 ,例如:雄激素通過雄激素應(yīng)答原件(ARE)調(diào)節(jié) miR-26a的表達(dá),后者直接加快 LNCaP細(xì)胞雄激素非依賴性生長;同時(shí) miR-26a的靶基因是 BAK1,BBC3,p53,通過影響這些位點(diǎn)可以抑制細(xì)胞凋亡 ,促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。結(jié)論,提示 miR-26a在前列腺癌診斷中相比于 PSA存在優(yōu)勢,可以早期預(yù)判腫瘤的惡性程度。