魏微微,王亞洲,孟凡石

(佳木斯大學臨床醫(yī)學院,黑龍江 佳木斯 154003)

目前幽門螺旋桿菌被公認感染是可以增加細胞的增殖活性,并且通過使其抑癌基因失活及其癌基因激活從而使胃黏膜上皮細胞發(fā)生癌變。在胃癌機制分子生物學水平上,核因子κB(nuclear factor kappa B,N F-κ B)是一類具有和某些基因上啟動因子區(qū)固頂核苷酸序列結合而啟動基因轉錄的功能性蛋白質,因此諸多因素可以使 NF-κB促進基因轉錄活性增強,導致某些控制細胞轉化靶基因轉錄增強,并且誘發(fā)腫瘤的發(fā)生。王維[1,2]等所應用免疫組化方法檢測檢測了有41例胃癌和25例相應非癌組織中 NF-κ B的表發(fā)達,而正常顯示無論是胃黏膜還是腸型化生以及不典型增生和胃癌組織中,陽性率逐漸升高 ,同時在低分化期、進展期、還有有淋巴結轉移和浸潤至漿膜的胃癌組織中,增高尤為明顯。而P73蛋白是在1997年發(fā)現的和 P53具有十分相似的結構和功能的新基因,近年來研究表明 P73在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、預后等方面起重要作用,國內國外研究過程中發(fā)現,進一步分析P73的過表達與胃癌臨床病例參數之間的關系有所發(fā)現,由于腫瘤體積增大,浸潤深度增加及淋巴結轉移,P73mRN A表達有越加增高趨勢。許許多多的資料表明 ,NF-κ B、P73與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、浸潤和轉移以及腫瘤耐藥問題有著緊密的相關。對于 Hp與 N F-κB、P73表達兩者之間的相關性研究國內外尚無研究,進一步探討 Hp感染誘發(fā)胃癌發(fā)生的機制,并進一步研究兩者在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用和意義及其與胃癌生物學行為的關系。

1 材料與方法

1.1 試驗對象及分組

選取 2012-01～ 2013-03佳木斯大學附屬第一醫(yī)院普外科胃癌手術住院病人100例 ,其中男60例,女40例。入選條件:①年齡 30～ 85歲;②術前未經過化療、放療、生物治療;③所有病例均采用:標準根治術,標準根治術是胃切除范圍為全胃2/3以上,淋巴結清除范圍為 D2的清除術 ,適應證是T1中直徑 ＞ 2.1cm、N1(+ )和原發(fā)癌為 T2～ T3、淋巴結轉移為 N0～N2(+)者,術前、術中檢查無腹膜轉移與肝轉移,進行 D2清除術可獲 A級 (絕對 )B級 (相對 )根治術。所有病例均由有經驗的病理醫(yī)師進行印象觀察,并經病理檢查證實。

1.2 實驗方法

標本經 10%福爾馬林固定,常規(guī)脫水,石蠟包埋,4 μm厚連續(xù)切片,選取染色較好的切片進行病理復查及免疫組化檢測。臨床病理診斷為高分化腺癌;中分化腺癌;低分化腺癌;浸潤出漿膜;有淋巴結轉移者;無轉移者。獲取癌旁正常組織,作為對照。

1.2.1 HP檢測:Warthin- Starry銀染法觀察 HP感染情況。

1.2.2 P73,N F-κ B的檢測:SupervisionTM二步法免疫組化染色。

1.2.3 結果判定

(1)結果判定標準:HP感染:Warthin-Starry銀染法觀察 Hp感染情況,若有 Hp感染為棕黑色。

N F-κB判定標準:NF-κ Bp65以細胞漿中出現棕黃色細顆粒狀沉淀,染色強度高于背景非特異性染色者為陽性。

P73判定標準:P73染色陽性信號為棕紅(褐)色,定位于細胞核和細胞漿,染色強度高于背景非特異性染色者為陽性。

(2)結果分級:HP感染結果分級:W-S染色分級標準:0級:未見細菌;1級:偶有細菌;2級細菌數目介于1級和 3級之間;3級:所有視野內見大量細菌。

NF-κB判定結果分級:高倍鏡下取10個不同視野 ,每個視野計數100個細胞,取其平均值,按陽性細胞所占百分率,并且結合染色強度分析。參照許良中等[3]制訂的判斷標準進行打分,先將染色強度打分(A分):0分為無色,1分為淡黃色,2分為棕黃色,3分為棕褐色。然后將陽性細胞所占的百分打分 (B分):0分為陰性,1分為陽性細胞 ＜5%,2分為陽性細胞在 5%～ 25%,3分為陽性細胞在25%～50%,4為陽性細胞＞50%。根據兩項指標積分數 (積分=A×B)高低分為:0、1分為陰性(-),2、3分為 弱陽性(±),4、 6分為陽性 (+);8、9、12分()為強陽性。以-和±為表達陰性(-),+和為表達陽性(+ )。

P73判定結果分級:參照文獻[4],每張切片都隨機選5個高倍視野 ,每個高倍視野計數200個細胞,觀察陽性細胞染色強度,并且計數陽性細胞百分比,按陽性細胞數所占百分比進行打分:可分為 0分為小于 5%,1分為 5%～25%,2分為25%～50%,3分為 50%～75%,4分為大于75%。根據其染色強度進行打分:又可分為0分無色,1分淺黃色,2分棕黃色,3分棕褐色。染色強度×陽性細胞百分數可分為:9～12分為強陽性(),5～ 8分為陽性(+ ),0～4分為陰性(-)。為了方便于統(tǒng)計學進行分析,強陽性和陽性合并成為陽性一組。

1.3 儀器與試劑

1.3.1 主要試劑

幽門螺旋桿菌快速尿素酶試紙購于珠海克迪公司;FHIT多克隆抗體(一抗)購于英國 Abcam公司;P73鼠抗人單克隆抗體購于北京中杉公司;NF-κBp65鼠抗人單克隆抗體購于北京中杉公司;免疫組化 PV-9000試劑盒購于福州邁新生物技術有限公司。

1.3.2 主要儀器

全自動生物組織脫水機沈陽市龍首電子儀器有限公司;石蠟包埋機、冷凍臺、攤片機、烤片機均為孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司;石蠟切片德國 Microm公司。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用 SPSS10.0軟件包進行統(tǒng)計分析。采用卡方檢驗方法,Fisher精確概率法及 Spearman等級相關對相應資料進行分析,取0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 胃癌患者 HP感染情況

Warthin-Starry銀染法觀察胃癌患者的 Hp感染情況,若出現棕黑色則有 HP感染,該患者列為 HP感染組,相反,為 HP感染組;兩組患者進行卡方檢驗 (i2= 1.07,P＞ 0.05),胃癌組織中 HP感染率為66.00%,癌旁正常組織作為對照組,癌旁組織的 HP感染率21.31%,見表 1。

表1 胃癌患者 HP感染情況

2.2 胃癌患者 NF-κBp65蛋白的表達情況

N F-κ Bp65蛋白在胃癌組織中(HP感染組和非 HP感染組之和)的表達陽性率為52.39%,癌旁組織(對照組 )的表達率為4.00%,正常胃黏膜中未檢出 NF-κBp65蛋白,HP感染組患者 NF-κ Bp65蛋白表達陽性率為31.81%,非 HP感染組患者 NF-κ Bp65蛋白表達陽性率為20.58%。HP感染組、非 HP感染組和對照組的 P73蛋白表達情況(i2= 13.77,P ＜ 0.05),見表 2。

表2 胃癌患者 NF-κBp65蛋白表達情況

2.3 胃癌患者 P73蛋白的表達情況

P73蛋白在胃癌組織中(HP感染組和非 HP感染組之和 )的表達陽性率為52.50%,癌旁組織(對照組)的表達率為0%,正常胃黏膜中未檢出 P73蛋白,HP感染組患者 P73蛋白表達陽性率為34.85%,非 HP感染組患者 P73蛋白表達陽性率為17.65%。HP感染組、非 HP感染組和對照組的 P73蛋白表達情況 (i2= 22.23,P＜0.05),見表3。

表3 胃癌患者 P73蛋白表達情況

3 討論

胃癌是消化道系統(tǒng)常見惡性腫瘤之一,是占居我國癌發(fā)病和死亡率最高的[5],而且是逐年上升不斷的增長趨勢,對胃癌研究已經深人到多種基因突變和蛋白分子表達。癌細胞分裂增殖越旺盛,以致胃癌的惡性生長和浸潤以及轉移越快。

幽門螺桿菌是全世界范圍乃至全球相對比較高感染率的慢性感染性致病菌之一,全世界以有50%之上的人口感染HP,據資料顯示,HP的感染率達為40%～80%為慢性胃炎患者,而且在慢性活動性胃炎患者中可達90%以上為幽門螺桿菌感染,胃潰瘍患者感染率也可達60%～100%,胃癌患者的感染率則為43%～78%。胃部疾病的發(fā)生、發(fā)展都跟幽門螺桿菌的感染有著密相關,并且其中大量 HP是誘發(fā)胃癌形成的重要危險因素[6]本研次究結果顯示各組 HP感染率分別為:胃癌組織中 HP感染率 66.00%,癌旁組織 HP感染率為21.31%,正常胃黏膜無 HP感染。

3.1 NF-κ Bp與胃癌發(fā)生的關系

核轉錄因子 NF-κ B的失控而導致的,N F-κB在腫瘤中的異常激活可能是腫瘤細胞抗凋亡的主要途徑之一[8,9,15]。同時 N F-κ B還通過非凋亡的形式來促進腫瘤的形成:即也可通過激活原癌基因 c-myc及 cyclinD1直接刺激增生。HinzM等實驗研究發(fā)現,核轉錄因子 N F-κ B的靶基因是細胞周期素 cyclinD1,cyclinD1的轉錄可被 N F-κ B啟動 ,可使 Gl/G向 S期過渡,以致細胞增殖,最終使細胞向惡性轉化、癌變。

實驗研究過程中,N F-κ Bp65在52例中有 HP感染胃癌患者中陽性表達率可達到為 31.81%,N F-κ Bp65在無 HP感染胃癌患者中陽性表達率為20.58%,N F-κ Bp65在癌旁組織中陽性表達率為4.00%,而正常胃黏膜中 N F-κ Bp65均為陰性。有 HP感染和無 HP感染胃癌患者的 N F-κ Bp65表達陽性率有統(tǒng)計學差異 (P＜0.05),且 HP感染組的 N F-κBp65蛋白表達陽性率高于無 HP感染組,提示胃癌患者的N F-κ Bp65蛋白表達與 HP感染存在相關性,即有 HP感染,N F-κ Bp65蛋白的表達會增高。HP感染組、無 HP感染組及對照組(癌旁正常組織)的 NF-κ Bp65蛋白表達陽性率比較有統(tǒng)計學意義 (P ＜0.05),且 HP感染組和無 HP感染組的N F-κ Bp65蛋白的表達均高于對照組 ,提示 N F-κ Bp65蛋白在胃癌組織中的陽性表達率比較高的,且陽性表達隨著腫瘤的惡性程度呈現逐漸上升趨勢。

3.2 P53基因與胃癌發(fā)生的關系

具有“分子警察基因”和“凋亡基因”之稱的基因是 P53基因。根據文獻報道大約50%的人類腫瘤中缺乏野生型P53,所以免疫組化方法檢出的 P53蛋白均屬于突變型[14]。應用免疫組化方法可以檢測出 P53蛋白的異常表達,同時反映出 P53突變蛋白在核內的積累。最近幾年來應用免疫組化方法檢測證實 P53蛋白在胃癌組織中有過度的表達,本篇文章采用免疫組化技術檢測的100例胃癌組織標本,P53蛋白陽性表達率為52.50%,低于國內國外文獻報道中的水平。經過本研究檢測到的 P53蛋白陽性反應物全部都為癌變細胞,鄰近的間質及相應正常黏膜上皮均未見陽性表達,這一結果與國內國外文獻報道相一致。HP感染組、非 HP感染組和對照組P73蛋白表達有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05),說明胃癌患者 P73蛋白表達與 HP感染存在相關性,目前,對胃癌患者 P73蛋白表達與 HP感染存在之間的關系研究尚不明確,仍有待于進一步研究。

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