佟麗波,王 晶,王春敏,朱貴明,姚海濤,盧北燕,佟秀鳳,張 燕

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 佳木斯 154003;2.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,黑龍江 佳木斯 154007)

子宮內(nèi)膜癌是婦科最重要的惡性腫瘤之一,在西方發(fā)達國家其發(fā)病率居女性生殖器官惡性腫瘤的第一位。近年來中國子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率也有明顯上升的趨勢,通過對子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展機制的認識可以從根本上提高其預(yù)防診斷和治療水平[1]。上皮型鈣黏蛋白-E是細胞間黏附分子的重要成員,不光介導(dǎo)細胞之間的黏附,而且細胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)也可直接參與。對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移相關(guān)[2]。KLK7基因近年來研究發(fā)現(xiàn)在人體許多組織和器官中均有表達,而且和多種腫瘤的生長、發(fā)展、浸潤相關(guān)。本實驗通過檢測重組人激肽釋放酶7蛋白和 E-鈣黏蛋白在增生期子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜不典型增生、子宮內(nèi)膜癌中的表達情況,探討研究其表達與子宮內(nèi)膜癌的關(guān)系及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料來源及分組

收集佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科存檔蠟塊(2007～

2012年 )均為在本院第一次手術(shù),術(shù)前未進行放、化療治療,將實驗分為3組。Ι組:子宮內(nèi)膜不典型增生30例,子宮切除術(shù)后病理診斷為子宮內(nèi)膜不典型增生中度-重度。年齡36～55歲,平均 47.5歲。Ⅱ組:子宮內(nèi)膜癌組 35例,子宮切除術(shù)后經(jīng)病理診斷為子宮內(nèi)膜腺癌,其中浸潤淺肌層為16例,浸潤深肌層為9例。年齡35～ 74歲,平均 57.3歲。Ⅲ 組:對照組16例,門診行診斷性刮宮術(shù),術(shù)后病理診斷為功血 ,均為增生期。術(shù)前均未用過性激素類藥物治療。年齡25～ 48歲,平均41.2歲。以上實驗標(biāo)本均由病理科醫(yī)師證實。

1.2 主要試劑

免抗人 KLK7多克隆抗體(北京博奧森公司),免抗 E-cad多克隆抗體 (福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司),DAB顯色試劑盒(福州邁新公司),SP免疫組化試劑盒 (福州邁新公司)。

1.3 實驗方法

(1)將固定于福爾馬林中的標(biāo)本進行烤片,68℃烘烤20min。(2)常規(guī)二甲苯脫蠟,梯度酒精脫水。(3)阻斷 滅活內(nèi)源性過氧化物酶。(4)將檸檬酸鈉緩沖液置于容器后放入組織,加熱冷卻2次。(5)用 PBS沖洗血清封閉、孵育。(6)滴加按照試劑盒說明書操作,KLK7抗體工作液稀釋比例為1:100,E-cad抗體工作液稀釋比例為 1:200。4℃過夜。(7)PBS沖洗三次。(8)滴入二抗,孵育。(9)加入 DAB顯色劑。(10)封片。

1.4 結(jié)果判定

KLK7蛋白為細胞漿或細胞膜表達,呈棕黃色著色為陽性表達。E-cad蛋白為細胞膜表達,呈棕黃色著色為陽性表達。按照細胞陽性著色程度(抗原含量 )可分為:細胞無顯著著色者為()記0分,淺黃色弱陽性者為()記1分,棕黃色中等陽性者為)記 2分,棕褐色強陽性者為)記3分;按照陽性細胞數(shù)量可分為:弱陽性(指陽性細胞數(shù)占總細胞數(shù)25%以下)者(),中等陽性(指陽性細胞數(shù)占總細胞數(shù)25%～ 49%)者(),強陽性 (指陽性細胞數(shù)占總細胞數(shù)50%以上 )()。應(yīng)用積分綜合計量。計算公式:()%×0+()%× 1+ ()%×2+()%× 3:;總數(shù)值 ＜1.0者為(+),1.0～1.5者為 (),＞ 1.5者為 ()。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

所得的全部數(shù)據(jù)采用 SPSS16.0統(tǒng)計軟件,進行i2檢驗,以P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KLK7蛋白在正常組、子宮內(nèi)膜不典型增生及子宮內(nèi)膜癌中的表達:正常組為12.5%,在子宮內(nèi)膜不典型性增生組為 85%,在子宮內(nèi)膜癌中的表達為92%。與正常組比較,子宮內(nèi)膜不典型性增生組升高 ,有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05)。正常組與子宮內(nèi)膜癌比較,KLK7蛋白的陽性表達率顯著增高(P ＜ 0.05)。見表 1。

表1 KLK7蛋白子宮內(nèi)膜癌中的表達

2.2 E-cad蛋白在正常組、子宮內(nèi)膜不典型增生及子宮內(nèi)膜癌中的表達:正常組為81.25%,在子宮內(nèi)膜不典型性增生組為 65%,在子宮內(nèi)膜癌中的表達為44%。與正常組比較,子宮內(nèi)膜不典型性增生組升高 ,有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05)。正常組與子宮內(nèi)膜癌比較,E-cad蛋白的陽性表達率顯著增高(P ＜ 0.05)。見表 2。

表2 E-cad蛋白子宮內(nèi)膜癌中的表達

3 討論

子宮內(nèi)膜癌是常見的婦科惡性腫瘤之一,多發(fā)于圍絕經(jīng)期女性和絕經(jīng)后女性,是導(dǎo)致死亡的僅次于卵巢癌和宮頸癌的第三名婦科惡性腫瘤[3]。目前發(fā)病率有逐年升高的趨勢。研究發(fā)現(xiàn)其發(fā)病與生活方式關(guān)系密切,不同地域發(fā)病率不同,在北美和歐洲發(fā)病率高居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之首。在我國子宮內(nèi)膜癌隨著社會發(fā)展和生活水平的提高,發(fā)病率也有上升的趨勢?，F(xiàn)排在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤第二位,僅次于宮頸癌。

KLK7蛋白是一種絲氨酸蛋白,是組織激肽釋放酶(KLK)基因家族的新成員,最早被在人足底皮膚的角化層中分離提純[4]。KLK7蛋白主要是在角質(zhì)層上皮細胞表達。目前發(fā)現(xiàn)它廣泛分布在人體組織和器官中,參與皮膚脫屑的過程[5]。對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移起著重要的作用。腫瘤細胞表層的 KLK7蛋白可能對腫瘤細胞的脫落及轉(zhuǎn)移有影響。相關(guān)研究表明[6],KLK7基因在胰腺癌組織中表達顯著加強,該基因的表達與胰腺癌的預(yù)后有關(guān)。通過本實驗發(fā)現(xiàn),KLK7基因在子宮內(nèi)膜癌中的陽性率表達明顯高于子宮內(nèi)膜不典型性增生和正常子宮內(nèi)膜。KLK7基因在子宮內(nèi)膜上升趨勢的高表達表示該基因可能導(dǎo)致腫瘤細胞發(fā)生、發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移的一個重要潛在因素。加上 KLK7在皮膚中就具有促進角質(zhì)層細胞脫落的作用,綜上,我們推測出 KLK7基因在子宮內(nèi)膜癌中的作用很有可能與絲氨酸蛋白酶參與細胞間質(zhì)的溶解和腫瘤細胞早期脫落有關(guān),而且與促進癌細胞進一步浸潤和轉(zhuǎn)移。由此可見,對 KLK7蛋白廣泛深入的研究,可了解腫瘤細胞浸潤和擴散的具體機制,為腫瘤的臨床治療提供理論依據(jù)。

E-cadherin是一種分子量為120KD的鈣依賴性黏附蛋白分子,主要在上皮細胞中分布,在細胞的形態(tài)發(fā)生和維持上皮的完整性以及同型細胞間的黏附、腫瘤細胞間保持密切接觸等方面有著重要影響。E-cad蛋白正常情況下均在細胞邊緣區(qū)成陽性表達,但在腫瘤組織中一般為低表達或是陰性表達。其低表達或是缺失可導(dǎo)致同型細胞或腫瘤細胞間的結(jié)構(gòu)和功能異常,使介導(dǎo)細胞的黏附功能降低或喪失,而無限制增生導(dǎo)致使腫瘤浸潤和擴散轉(zhuǎn)移[7,8]。本實驗表明,E-cad蛋白在子宮內(nèi)膜癌、子宮內(nèi)膜不典型性增生和正常子宮內(nèi)膜組織中的表達明顯下降,說明 E-cad蛋白的表達與腫瘤的發(fā)生有著密切的相關(guān)性。與相關(guān)研究結(jié)果相符合。進而可推測 E-cad蛋白低表達時可使細胞間黏附功能降低且腫瘤細胞間喪失接觸性抑制,腫瘤細胞更容易分離、增生、脫落,擴散。

本研究顯示,KLK7蛋白與E-cad蛋白在子宮內(nèi)膜癌的陽性表達呈明顯的負相關(guān)性,由實驗結(jié)果可推斷,KLK7蛋白與 E-cad蛋白在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及浸潤中有著密切的關(guān)系。E-cad蛋白在正常子宮內(nèi)膜中的高表達說明其維持著子宮內(nèi)膜上皮的完整性,當(dāng) E-cad的陽性率降低時可能引起腫瘤細胞有離散的趨勢,容易與原發(fā)灶脫落,出現(xiàn)浸潤臨近的組織,發(fā)生轉(zhuǎn)移。與相關(guān)研究結(jié)果相符合。進而可推測 E-cad蛋白低表達時可使細胞間黏附功能降低且腫瘤細胞間喪失接觸性抑制,腫瘤細胞更容易分離、增生增值、脫落,擴散。因此,E-cad的缺失表達提示著 E-cad蛋白參與者腫瘤細胞的發(fā)生與發(fā)展,當(dāng) E-cad蛋白缺失時,腫瘤細胞將具有更高的侵襲力和不良的預(yù)后。研究發(fā)現(xiàn),KLK7蛋白可以通過裂解 E-鈣黏蛋白而增強癌細胞侵襲細胞外基質(zhì)的能力,阻斷其連接,減少聚合能力。說明 KLK7蛋白和 E-cad蛋白在癌細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移中起著重要的作用。

總之,腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移是非常復(fù)雜的生物學(xué)行為,許多轉(zhuǎn)移基因和轉(zhuǎn)移抑制基因都和此過程密切相關(guān)。通過本實驗研究分析,在子宮內(nèi)膜癌中,KLK7蛋白和 E-cad蛋白的表達呈負相關(guān)性,兩者協(xié)同參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移等過程。綜上所述,KLK7蛋白和 E-cad蛋白在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用,對監(jiān)測子宮內(nèi)膜癌患者的病情及預(yù)后有著重要的意義。但兩者確切的生理功能、蛋白作用機制和基因調(diào)控機制,相互作用機制尚未完全清楚,尚待進一步研究。

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