張東東,扈清云,王培軍,歐葉濤,韓 曦,陳乃峰,尹興忠,鐘堂武,梁衍鋒

(佳木斯大學基礎醫(yī)學院,黑龍江 佳木斯 154007)

膀胱癌是一種最常見的原發(fā)于膀胱上皮細胞的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤,其惡性程度和復發(fā)率較高。通過研究發(fā)現(xiàn)導致膀胱癌的原因有很多,其中基因和生活環(huán)境尤為主要。通過以往的研究發(fā)現(xiàn)當膀胱細胞內一個或多個抗癌基因的失活或癌基因的激活膀胱癌的發(fā)生主要因素。因此,我們通過分子遺傳學研究膀胱癌不僅有助于膀胱癌的發(fā)病機制及膀胱腫瘤基因的研究,而且對膀胱腫瘤的診斷及預后均有著十分重要的指導意義。本實驗主要研究的是 EphA2(erythropoietin producing hepatoma cell line A2),EphA2是 EphA亞家族受體8個成員中的第2個[1,2]。在人的多種細胞系或組織中都有 EphA2表達。人類 EphA2基因位于染色體1p36.1上,其含有 17個外顯子。EphA2能夠調節(jié)細胞增生主要體現(xiàn)在:EphA2的過度表達時能使正常細胞發(fā)生變異[3],正常情況下當 EphA2與配體結合后,削弱誘導細胞生長的生長因子活性,從而抑制了細胞的生長。因此當 EphA2正常表達時可抑制細胞發(fā)生增生,異常表達時則可以促進細胞轉化。本次實驗采用免疫組織化學法和 RT-PCR法檢測正常膀胱組織與膀胱癌組織中的 EphA2異常表達率,通過本次試驗分析正常膀胱組織和膀胱癌組織中 EphA2表達,觀察蛋白水平和基因水平表達的相互關系,能為膀胱癌在其發(fā)病、診斷治療以及臨床預后提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗材料來自于佳木斯大學附屬第一醫(yī)院,其中正常膀胱組織新鮮的10例,膀胱癌組織新鮮的31例,此外還有膀胱癌石蠟組織標本40例。

1.2 實驗試劑

瓊脂糖,DEPC液,枸櫞酸緩沖液,DAB顯色試劑盒,兔抗人 EphA2多克隆抗體,2000bpMarker,PBS緩沖液,Taq DN A聚合酶,引物,Trizol,GAPDH,SABC試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司),RNA提取試劑盒(上海生工生物工程技術有限公司),反轉錄試劑盒 (寶生物工程(大連)有限公司)等。

1.3 實驗方法

1.3.1 1RT-PCR法:實驗前將所有使用器具用濃硫酸和DEPC水浸泡,高溫高壓消毒,烘干保存。

1.3.2 提取正常膀胱組織和膀胱癌組織的 RN A并檢測:首先使用勻漿器將癌組織和正常膀胱組織進行勻漿處理,其次將勻漿后的組織加入提取液離心,最后加 RNA抑制酶離心后保存。使用凝膠電泳檢測提取的 RN A是否完整。

1.3.3 反轉錄:將提取到的 mRN A進行反轉錄得到相應的cDN A并對其擴增。

1.3.4 RT-PCR:制備標準曲線,進行瓊脂糖凝膠電泳。

1.3.5 將 RT-PCR實驗所得凝膠利用天能 GIS凝膠圖像處理系統(tǒng)對進行分析,得出數(shù)據(jù)。

1.4 免疫組化(SABC)法

本實驗標本包括新鮮組織標本和膀胱癌石蠟組織標本,先將新鮮組織標本進行固定后脫水形成石蠟標本。將所有石蠟組織切片常規(guī)免疫組化處理加入兔抗人 EphA2多克隆抗體封片計數(shù)。

1.5 統(tǒng)計學處理

利用 SPSS16.0軟件對所得出的數(shù)據(jù)進行 t檢驗和卡方檢驗,P＜0.05有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 RT-PCR法 EphA2的檢測

通過 RT-PCR法檢測發(fā)現(xiàn) EphA2在膀胱癌組織中的表達明顯高于正常膀胱組織的表達。

表1 RT-PCR法檢測 Eph A2在正常膀胱組織和膀胱癌組織的表達

2.2 免疫組化 EphA2的檢測

EphA2免疫組化陽性物質呈棕黃色,EphA2免疫染色定位在膀胱細胞膜和細胞漿,在正常膀胱黏膜上皮中,EphA2呈陰性或弱陽性表達。而當膀胱發(fā)生癌癥病變時會隨著癌癥的分化高低的不同而改變。分化越高表達越低,分化越低表達越高。通過免疫組化法發(fā)現(xiàn)在膀胱癌組織中 EphA2的異常率表達為77.46%(55/71),正常膀胱黏膜組織異常率的表達為20%,EphA2在膀胱癌組織中的異常表達率明顯高于正常組織 (P ＜ 0.01)。

表2 免疫組化(SABC)法分析 EphA2在正常膀胱組織和膀胱癌組織的表達

3 討論

在研究發(fā)現(xiàn) EphA2對細胞的增生具有一定的調節(jié)作用[4,5]。通過在蛋白水平研究表明 EphA2在膀胱移行細胞癌中發(fā)現(xiàn):當 EphA2在正常表達情況下可抑制細胞增生,而異常表達時可以促進細胞的轉化。本實驗采用 RT-PCR法以及免疫組織化學技術,檢測了71例膀胱移行細胞癌和10例正常膀胱組織的 EphA2的表達情況發(fā)現(xiàn):在基因水平上膀胱移行細胞癌的 EphA2表達高于正常膀胱組織中的 EphA2表達,利用免疫組織化學方法蛋白檢測膀胱移行細胞癌的EphA2表達高于正常膀胱組織中的 EphA2表達,兩種檢測方法得出的結論一致。本研究得到:在膀胱移行細胞癌中EphA2的基因與蛋白有著重要的聯(lián)系,EphA2的基因決定了EphA2蛋白的表達。這一結果提示 EphA2在膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起著十分重要的作用,從而為膀胱癌的發(fā)生、診斷和治療等提供基礎理論依據(jù)。

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