劉 瑛，俞 靜，張 良，沈立松

肺炎克雷伯菌廣泛分布于自然界，存在于土壤和水中，人和動(dòng)物腸道內(nèi)更為常見(jiàn)。肺炎克雷伯菌可引起典型的原發(fā)性肺炎，也可引起各種肺外感染，常見(jiàn)有嬰兒腸炎、腦膜炎，成人泌尿系感染、外傷感染和血流感染等。碳青霉烯類(lèi)抗生素是目前治療腸桿菌科細(xì)菌包括肺炎克雷伯菌，尤其是產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶（ESBLs）和AmpC酶等多重耐藥菌引起的嚴(yán)重感染最有效的抗菌藥物之一。近年來(lái)，隨著這類(lèi)抗生素的廣泛應(yīng)用，臨床逐漸出現(xiàn)了耐碳青霉烯類(lèi)抗生素的腸桿菌科細(xì)菌，特別是耐碳青霉烯類(lèi)抗生素肺炎克雷伯菌的報(bào)道日見(jiàn)增多，所涉及的國(guó)家和區(qū)域越來(lái)越廣，成為臨床抗該菌感染治療的棘手問(wèn)題。

本研究收集我院臨床微生物室2012年3月從1例男性膀胱癌術(shù)后患者的血、尿、痰、盆腔引流液4種標(biāo)本中分離得到的不重復(fù)的4株耐碳青霉烯類(lèi)抗生素肺炎克雷伯菌，并對(duì)其耐藥機(jī)制和同源性進(jìn)行了分析，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

材料與方法

一、材料

（一）菌株來(lái)源 我院臨床微生物實(shí)驗(yàn)室從1例男性膀胱癌術(shù)后患者的血、尿、痰和盆腔引流液中先后分離到4株對(duì)包括厄他培南和亞胺培南在內(nèi)的所有臨床常用抗菌藥物均耐藥的肺炎克雷伯菌，分別命名為Kpsck1、Kpsck2、Kpsck3和Kpsck4。質(zhì)控株為大腸埃希菌ATCC 25922、銅綠假單胞菌ATCC27853、肺炎克雷伯菌ATCC700603，由上海市臨床檢驗(yàn)中心提供。產(chǎn)KPC－2酶肺炎克雷伯菌（LYKPC）由上海第六人民醫(yī)院檢驗(yàn)科惠贈(zèng)。IMP和VIM陽(yáng)性菌株由上海瑞金醫(yī)院微生物科惠贈(zèng)。

（二）儀器與試劑 VITEK2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)及革蘭陰性桿菌鑒定卡（GNI）、革蘭陰性桿菌藥敏卡（GN13）購(gòu)自法國(guó)Bio Mérieux公司，Mastercycler EP Gradient Thermal Cycler PCR儀購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司，ABI Prism310 Genetic Analyzer DNA測(cè)序儀購(gòu)自美國(guó) Applied Biosystems公司，SDS－PAGE電泳裝置及電泳儀購(gòu)自美國(guó)Bio－Rad公司，PCR擴(kuò)增試劑盒及DNA膠回收試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程公司，基因測(cè)序擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司，厄他培南紙片（10μg）購(gòu)自英國(guó)OXOID公司。

二、方法

（一）菌株鑒定和藥敏試驗(yàn) 所有菌株均由VITEK－2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)進(jìn)行鑒定及藥敏試驗(yàn)，藥敏判斷標(biāo)準(zhǔn)及質(zhì)控遵循2011年版CLSI［1］標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。

（二）改良Hodge試驗(yàn) 根據(jù)2009年版CLSI［2］推薦，將0.5麥?zhǔn)蠁挝坏拇竽c埃希菌 ATCC 25922菌液稀釋10倍后均勻涂布在MH平皿上，中間貼10μg／片厄他培南的紙片，將受試菌株以厄他培南紙片為起點(diǎn)，沿離心方向劃線(xiàn)，35℃培養(yǎng)過(guò)夜，抑菌圈內(nèi)呈現(xiàn)矢狀者為陽(yáng)性。肺炎克雷伯菌ATCC 700603為陰性對(duì)照株，肺炎克雷伯菌LYKPC作為陽(yáng)性對(duì)照株。

（三）PCR擴(kuò)增及測(cè)序 按文獻(xiàn)［3］報(bào)道采用水煮法提取菌株DNA。采用PCR方法擴(kuò)增碳青霉烯酶基因，包括blaKPC－2、blaIMP－1、blaIMP－2、blaVIM－1、blaVIM－2、blaNDM－1和blaOXA－487種常見(jiàn)基因。引物及擴(kuò)增條件見(jiàn)參考文獻(xiàn)（表1）。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，于紫外凝膠成像儀觀察并攝片。

表1 7種碳青霉烯酶基因的引物Table 1 Primers of 7 carbapenemase genes

（四）基因測(cè)序 待測(cè)序的PCR擴(kuò)增陽(yáng)性產(chǎn)物經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離后，割取對(duì)應(yīng)位置的含清晰DNA條帶的瓊脂凝膠塊，用DNA膠回收試劑盒回收得到測(cè)序單向PCR反應(yīng)的模板，單向PCR反應(yīng)的具體體系與擴(kuò)增程序參考BigDye Terminator v3.1測(cè)序試劑盒操作手冊(cè)，單向PCR反應(yīng)產(chǎn)物利用ABI Prism310 Genetic Analyzer DNA測(cè)序儀測(cè)序。

（五）外膜蛋白SDS－PAGE電泳分析 通過(guò)超聲破壁法制備肺炎克雷伯菌外膜蛋白［9］，從細(xì)菌細(xì)胞膜蛋白成分中分離得到月桂酰肌氨酸鈉不溶的蛋白組分作為外膜蛋白樣品，對(duì)外膜蛋白樣品進(jìn)行SDS－PAGE電泳分析，電泳結(jié)束后采用考馬斯亮藍(lán)R250染色。

（六）ERIC－PCR DNA 指紋圖譜分析 ERICPCR方法對(duì)4株耐碳青霉烯類(lèi)肺炎克雷伯菌和另1株同期分離自同一科室其他患者的尿標(biāo)本中肺炎克雷伯菌（Kpsck5）進(jìn)行同源性分析。引物序列為5－AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG－3［3］，PCR 反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參見(jiàn)文獻(xiàn)［10］。

結(jié) 果

一、菌株鑒定和藥敏試驗(yàn)結(jié)果

4株分離自血、尿、痰和盆腔引流液標(biāo)本的菌株經(jīng)VITEK2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)鑒定均為肺炎克雷伯菌，生化編碼均為：6607734653564010。藥敏結(jié)果顯示，4株細(xì)菌除了對(duì)厄他培南（MIC≥8 mg／L）和亞胺培南（MIC≥16 mg／L）耐藥外，還對(duì)頭孢唑林、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢吡肟、氨芐西林－舒巴坦、哌拉西林－他唑巴坦、頭孢替坦、氨曲南、阿卡米星、慶大霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星和甲氧芐啶－磺胺甲口惡唑耐藥（表2）。

表2 4株肺炎克雷伯菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果（mg／L）Table 2 The antimicrobial susceptibility of the 4 K.pneumoniae strains（mg／L）

二、改良Hodge試驗(yàn)

4株肺炎克雷伯菌改良Hodge試驗(yàn)結(jié)果均呈陽(yáng)性（圖1）。

圖1 肺炎克雷伯菌（Kpsck1）的改良Hodge試驗(yàn)結(jié)果Figure 1 Modified Hodge test result of Klebsiella pneumoniae（Kpsck1）

三、耐藥基因檢測(cè)及基因測(cè)序

對(duì)7種耐藥基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，4株肺炎克雷伯菌均在1 000 bp左右，有KPC－2基因的陽(yáng)性擴(kuò)增條帶（圖2）。PCR產(chǎn)物測(cè)序后于美國(guó)NCBI網(wǎng)站Blast軟件比對(duì)，證明PCR產(chǎn)物為KPC－2基因。4株 細(xì) 菌 均 未 檢 測(cè) 到 blaIMP－1、blaIMP－2、blaVIM－1、blaVIM－2、blaNDM－1和blaOXA－48等耐藥基因。

四、外膜蛋白組分分析

外膜蛋白SDS－PAGE電泳分析結(jié)果顯示，Kpsck1、Kpsck2、Kpsck3和Kpsck4的外膜蛋白圖譜完全相同，但與肺炎克雷伯菌ATCC700603的外膜蛋白圖譜不同。Kpsck1、Kpsck2、Kpsck3、Kpsck4及肺炎克雷伯菌ATCC700603的外膜蛋白中均存在35 ku左右的蛋白條帶。肺炎克雷伯菌ATCC700603表達(dá)的外膜蛋白中存在約36 ku的蛋白條帶，Kpsck1、Kpsck2、Kpsck3和Kpsck4的外膜蛋白圖譜中缺失36 ku大小的蛋白條帶，而出現(xiàn)了一條分子量大于36 ku的異常蛋白條帶（圖3）。

圖2 KPC－2基因PCR擴(kuò)增電泳圖譜Figure 2 Electrophoresis of KPC－2 PCR amplification products

圖3 肺炎克雷伯菌的外膜蛋白SDS－PAGE分析Figure 3 SDS－PAGE analysis of Klebsiella pneumoniae outer membrane porin

五、ERIC－PCR指紋圖譜

ERIC－PCR試驗(yàn)的結(jié)果顯示，Kpsck1、Kpsck2、Kpsck3和Kpsck4具有完全相同的DNA指紋圖譜（圖4），表明4株耐碳青霉烯類(lèi)肺炎克雷伯菌是同一克隆株。

討 論

圖4 5株肺炎克雷伯菌的ERIC－PCR指紋圖譜Figure 4 ERIC－PCR fingerprinting profiles of Klebsiella pneumoniae

腸桿菌科細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素的主要耐藥機(jī)制是產(chǎn)碳青霉烯酶，且以肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（KPC）為多見(jiàn)。KPC酶屬于Ambler分類(lèi)的A類(lèi)絲氨酸β內(nèi)酰胺酶，2001年在美國(guó)北卡羅來(lái)納州報(bào)道發(fā)現(xiàn)第1株產(chǎn)KPC酶的肺炎克雷伯臨床分離株［11］。自此之后KPC型β內(nèi)酰胺酶在諸多腸桿菌科細(xì)菌中被發(fā)現(xiàn)，迄今為止，已發(fā)現(xiàn)的KPC型酶達(dá)13種［12］。本研究中的4株肺炎克雷伯菌均檢出KPC－2基因，而其他 Ambler B類(lèi)酶包括IMP、VIM、NDM－1等金屬酶及D類(lèi)OXA－48型酶均未檢出。因此，產(chǎn)KPC－2型碳青霉烯酶是這4株細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素耐藥最主要的耐藥機(jī)制。KPC基因通常存在于可傳播的含有轉(zhuǎn)座子的質(zhì)粒中，這可使細(xì)菌耐藥性在不同種的細(xì)菌之間水平傳播［13］，增加了細(xì)菌獲得耐藥性的機(jī)會(huì)，引起醫(yī)院內(nèi)耐藥菌的播散和流行，對(duì)控制醫(yī)院感染和臨床治療是巨大的挑戰(zhàn)。

外膜蛋白是細(xì)菌與外界進(jìn)行物質(zhì)交換的重要通道，改變通道蛋白性質(zhì)和數(shù)量而降低細(xì)菌的膜通透性可以使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。肺炎克雷伯菌產(chǎn)生的主要外膜蛋白是OmpK35和OmpK36。已有文獻(xiàn)報(bào)道，碳青霉烯類(lèi)耐藥的肺炎克雷伯菌中缺失36 ku大小的外膜蛋白組分而引起細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)［14－15］。本研究中Kpsck1、Kpsck2、Kpsck3和Kpsck4的外膜蛋白圖譜中均缺失36 ku大小的蛋白條帶，而出現(xiàn)了一條分子量大于36 ku的異常蛋白條帶，異常外膜蛋白組分引起的細(xì)胞膜滲透性的改變與其碳青霉烯類(lèi)耐藥性相關(guān)，也可能導(dǎo)致此4株細(xì)菌的多重耐藥性。因此，本研究中的4株耐碳青霉烯類(lèi)抗生素肺炎克雷伯菌的主要耐藥機(jī)制為產(chǎn)KPC－2酶合并外膜蛋白異常引起的外膜蛋白通透性改變。

ERIC－PCR主要是以腸桿菌科細(xì)菌基因間非編碼區(qū)的重復(fù)共有序列為基礎(chǔ)進(jìn)行的PCR擴(kuò)增，是一種簡(jiǎn)單、靈敏度高、可重復(fù)性和可靠性較好的分子生物學(xué)分型方法，可對(duì)腸桿菌科細(xì)菌的同源性進(jìn)行分析。本研究中該例患者4個(gè)部位標(biāo)本中均檢出耐碳青霉烯類(lèi)抗生素肺炎克雷伯菌，且結(jié)果顯示為同一克隆型。表明該例患者是多臟器的全身泛耐藥肺炎克雷伯菌感染。

Hussein等［16］和 Gasink等［17］通過(guò)臨床資料對(duì)比研究，發(fā)現(xiàn)了感染碳青霉烯類(lèi)抗生素耐藥肺炎克雷伯菌的6種獨(dú)立危險(xiǎn)因素。回顧此患者的臨床資料：年齡79歲，因膀胱癌行根治性膀胱切除術(shù)，4周后首次從尿標(biāo)本中分離到泛耐藥肺炎克雷伯菌，期間曾先后進(jìn)行了帕尼培南、左氧氟沙星、亞胺培南和萬(wàn)古霉素等抗菌藥物治療，具備感染碳青霉烯類(lèi)抗生素耐藥肺炎克雷伯菌的危險(xiǎn)因素。值得一提的是，該患者的臨床標(biāo)本分離到耐碳青霉烯類(lèi)肺炎克雷伯菌后，臨床選用了阿莫西林－克拉維酸、磷霉素和多西環(huán)素治療，而后對(duì)患者血、尿、痰及盆腔引流液標(biāo)本進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，結(jié)果均為陰性。此案例說(shuō)明，盡管藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示分離自患者的肺炎克雷伯菌為泛耐藥株，但通過(guò)合適的抗菌藥物治療，尤其聯(lián)合用藥后細(xì)菌感染得到控制，這也給類(lèi)似嚴(yán)重感染患者的治療方案提供了參考依據(jù)。

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