戚建明，陳江漢，楊 軍

2.第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)征醫(yī)院。

1999至2006年，國(guó)內(nèi)期刊上發(fā)表了224篇與新型隱球菌病相關(guān)的論文，涉及到2 850例感染新型隱球菌的患者，僅69例（2.4%）與艾滋病有關(guān)［1－6］?，F(xiàn)對(duì)我國(guó)129株新型隱球菌臨床分離株進(jìn)行流行病學(xué)、分子生物學(xué)、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)分析，以明確我國(guó)新型隱球菌的主要感染人群。

材料與方法

一、菌株來源

129株新型隱球菌臨床株從不同的新型隱球菌病患者腦脊液中分離獲得，這些患者來自于我國(guó)中東部地區(qū)的18個(gè)省、直轄市，菌株保存在上海長(zhǎng)征醫(yī)院皮膚科新型隱球菌專業(yè)實(shí)驗(yàn)室，以“長(zhǎng)征”加數(shù)字命名（如長(zhǎng)征114，長(zhǎng)征186），所有菌株接種到L－刀豆氨酸－甘氨酸－溴百里酚藍(lán)培養(yǎng)基上，通過培養(yǎng)顯色區(qū)分新型隱球菌和格特隱球菌種屬［7］。標(biāo)準(zhǔn)株148（VNⅠ血清型A）、標(biāo)準(zhǔn)株63（VNB血清型A）、標(biāo)準(zhǔn)株626（VNⅡ血清型A）、標(biāo)準(zhǔn)株628（VNⅢ血清型D）、標(biāo)準(zhǔn)株629（VNⅣ血清型AD）和標(biāo)準(zhǔn)株179（VGⅠ血清型B）、標(biāo)準(zhǔn)株178（VGⅡ血清型B）、標(biāo)準(zhǔn)株161（VGⅢ血清型B）、標(biāo)準(zhǔn)株779（VGⅣ血清型C）和標(biāo)準(zhǔn)株99（血清型A）則由美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院 Kwon－Chung教授提供［8］。在研究過程中，所有菌株均25℃保存在YEPD培養(yǎng)基中（1%酵母抽提物，2%蛋白胨，2%葡萄糖）。

二、方法

（一）血清分型和MAT分型 血清分型采用Cryptocheck試劑盒（latron，日本東京），MAT分型采用 Kwon－Chung等［9］、Lengeler等［10］報(bào)道的顯色雜交法進(jìn)行。上述方法仍不能明確的，則以MAT等位基因?yàn)橐镄蠵CR分析。

（二）DNA提取 按照 Wang等［11］的氯化芐法操作，4℃保存抽提出的DNA。

（三）基因分型 基因分型方法包括M13微衛(wèi)星DNA引物PCR指紋圖譜和多位點(diǎn)序列分型（MLST）DNA序列分析。M13的引物序列為：5′－GAGGGTGGCGGTTCT－3′［12］，MLST 涉及位于新型隱球菌7個(gè)不同染色體上的8個(gè)不同基因，分別是 CAP10、GPD、IGS1、LAC1、PLB1、SOD1、TEF1和 URE1［13］。

PCR反應(yīng)體系：反應(yīng)總體積50μL，模板DNA 50～100 ng，上下游引物各 0.5 mmol／L，1.0U DNAzymeⅡ聚合酶，1.5mmol／L 氯化鎂，200 mmol／L dNTP；反應(yīng)條件：94℃變性1 min；95℃2 min，57 ℃ 1 min，72 ℃ 3 min，40個(gè)循環(huán)，72 ℃7 min。純化采用 QIAquick PCR Purification試劑盒（Qiagen，Valencia，CA，USA），采用凝膠電泳確認(rèn)擴(kuò)增產(chǎn)物。

（四）毒力研究 隨機(jī)選取3株來自中國(guó)的新型隱球菌臨床株（長(zhǎng)征114、長(zhǎng)征186和長(zhǎng)征193），3株血清A型標(biāo)準(zhǔn)株（標(biāo)準(zhǔn)株99、標(biāo)準(zhǔn)株148和標(biāo)準(zhǔn)株626）進(jìn)行毒力比較，將上述菌株配成含5×107cells的懸液，分別滴鼻感染9周齡雌性BALB／c小鼠，監(jiān)測(cè)生存狀況。

（五）無明顯免疫缺陷定義 已經(jīng)明確的新型隱球菌感染危險(xiǎn)因素有：HIV感染、惡性腫瘤、肝硬化、器官移植、終末期腎衰竭、自身免疫性疾病、糖尿病、特發(fā)性CD4＋T細(xì)胞減少癥、結(jié)節(jié)病、長(zhǎng)期使用皮質(zhì)類固醇激素或其他免疫療法等［14］，無上述任何易感因素人群定義為無明顯免疫缺陷人群。

結(jié) 果

一、感染人群

129株新型隱球菌臨床株是1980年至2006年從上海長(zhǎng)征醫(yī)院診治過的不同患者腦脊液中分離到，大部分患者主要表現(xiàn)出頭痛、惡心、嘔吐、發(fā)熱等中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染癥狀，部分患者有不同程度意識(shí)障礙?；颊呓?jīng)腰椎穿剌后，取腦脊液標(biāo)本送上海長(zhǎng)征醫(yī)院皮膚科新型隱球菌專業(yè)實(shí)驗(yàn)室，取離心后底部腦脊液，經(jīng)墨汁染色后鏡檢，主要觀察菌株的形狀及莢膜情況，同時(shí)行乳膠凝集試驗(yàn)，再取適量腦脊液于YEPD培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為1個(gè)月，在此時(shí)間段內(nèi)生長(zhǎng)的株菌，再行墨汁染色鏡檢、乳膠凝集試驗(yàn)、咖啡酸試驗(yàn)、尿素酶試驗(yàn)、37℃生長(zhǎng)試驗(yàn)，以培養(yǎng)后的檢查結(jié)果為準(zhǔn)，本次研究采用分子生物學(xué)的方法對(duì)129株臨床株再次確認(rèn)無誤。這些新型隱球菌患者來自中國(guó)中東部18個(gè)省、直轄市。2002年之前，每例新型隱球菌病患者常規(guī)行細(xì)胞免疫和體液免疫檢測(cè)，有異常者均行HIV血清學(xué)檢測(cè)，2002年以后，所有的新型隱球菌感染者均檢測(cè)相關(guān)免疫學(xué)指標(biāo)，包括HIV血清學(xué)、CD4＋細(xì)胞水平等。

依據(jù)患者的臨床資料及無明顯免疫缺陷的定義，129株臨床株中，70.5%（91／129）分離自無明顯免疫缺陷的患者，8.5%（11／129）分離自艾滋病患者，20.9%（27／129）分離自有其他基礎(chǔ)疾病的非HIV感染患者。129株臨床株均為MATα型，其中120株為血清A型新型隱球菌，9株為血清B型格特隱球菌。120株血清A型新型隱球菌來自中國(guó)中東部16個(gè)省、直轄市，84株（70.0%）分離自無明顯免疫缺陷患者，27株（22.5%）分離自除HIV外的其他危險(xiǎn)因素的患者，只有9株（7.5%）分離自艾滋病患者；9株血清B型格特隱球菌，1株來自山東，1株來自上海，5株來自浙江省的桉樹種植區(qū)，其他均來自氣候暖和的中國(guó)東南部。9株血清B型格特隱球菌中，2株分離自艾滋病患者，7株分離自無明顯免疫缺陷患者。

二、基因分型

120株血清A型新型隱球菌臨床株具有一致的M13指紋圖譜，將其中的12株與各標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行對(duì)比，其主要條帶與VNⅠ型標(biāo)準(zhǔn)株相同，但次要條帶不同于已知VNⅠ各亞型，屬于一種新的亞型，我們將其命名為VNⅠc型（圖1）。

圖1 12株我國(guó)新型隱球菌臨床株和標(biāo)準(zhǔn)株的M13分析DNA指紋圖譜Figure 1 DNA fingerprint patterns of 12 Cryptococcus neoformans clinical strains from China and the reference strains

在同其他菌株M13指紋圖譜比對(duì)的過程中，我們發(fā)現(xiàn)來自美國(guó) （美國(guó)8、美國(guó)48和美國(guó)5－36－17）、日本（日本1086和日本1088）、意大利743和馬拉維212i的7株新型隱球菌也呈現(xiàn)出VNⅠc指紋圖譜的特點(diǎn)（圖2）。對(duì)1株大陸血清A型臨床株和上述7株菌株進(jìn)行8個(gè)基因（CAP10、GPD、LAC1、PLB1、SOD1、IGS1、TEF1和 URE1）MLST，分析發(fā)現(xiàn)，明顯區(qū)別于VNⅠ標(biāo)準(zhǔn)株148。

圖2 8株VNⅠc型同VNⅠ型標(biāo)準(zhǔn)株148指紋圖譜比較Figure 2 DNA fingerprint patterns of 8 VNⅠc Cryptococcus neoformans strains and the WM148 reference strains

三、毒力研究

毒力分析結(jié)果顯示3株隨機(jī)選擇的中國(guó)新型隱球菌毒力低于標(biāo)準(zhǔn)株99，但明顯強(qiáng)于VNⅠ和VNⅡ標(biāo)準(zhǔn)株（圖3）。

圖3 新型隱球菌毒力研究結(jié)果Figure 3 Virulence research of Cryptococcus neoformans strains

討 論

此次研究分析了我國(guó)新型隱球菌臨床株流行病學(xué)特征，與巴西、澳大利亞、美國(guó)等其他國(guó)家血清A型新型隱球菌的基因多樣性相比顯示［15－16］，我國(guó)120株血清A型臨床株顯示出明顯的遺傳同質(zhì)性，這點(diǎn)在M13指紋圖譜和MLST結(jié)果均有體現(xiàn)。印度有研究者報(bào)道57株新型隱球菌臨床株遺傳多樣性與中國(guó)相似［17］，但有1株是血清D型。

值得注意的是，盡管我國(guó)已確診相當(dāng)多數(shù)量的艾滋病患者，但我國(guó)新型隱球菌病患者中，大部分無免疫缺陷或其他基礎(chǔ)疾病，我國(guó)大陸129株臨床株感染者中，只有11株（8.5%）分離自艾滋患者，91株（70.5%）分離自無明顯免疫缺陷患者，這與歐美超過80%、非洲超過69%隱球菌病感染者為艾滋病患者的報(bào)道顯著不同［18－20］。同樣的情況在澳大利亞、新西蘭、印度也有報(bào)道，在澳大利亞和新西蘭［21］，多數(shù)新型隱球菌病患者為非艾滋病患者，但有明顯免疫功能低下，這點(diǎn)與此次研究有所不同。印度報(bào)道41%新型隱球菌患者為HIV感染者［17］，但未提及其他59%的非HIV感染患者中是否有其他基礎(chǔ)疾病。

在此研究中，我們認(rèn)為70.5%新型隱球菌病患者無明顯免疫缺陷，基因因素可能在這些無明顯免疫缺陷的新型隱球菌病患者感染過程中扮演了重要角色，120株血清A型新型隱球菌臨床株具有一致的M13指紋圖譜，其主要條帶同VNⅠ型標(biāo)準(zhǔn)株相同，但次要條帶不同于已知的VNⅠ各亞型，屬于一種新的亞型，我們將其命名為VNⅠc型，MLST分析也顯示，我國(guó)VNⅠc亞型臨床株和前述7株菌株明顯區(qū)別于VNⅠ標(biāo)準(zhǔn)株 WM148，這7株VNⅠc株來自4個(gè)大洲［13］，這表明VNⅠc型在世界范圍內(nèi)廣泛分布，不是中國(guó)特有的，但這7株中是否大部分也分離自無明顯免疫缺陷者就難以追尋了。

一般情況下，無明顯的免疫缺陷或相關(guān)基礎(chǔ)疾病人群隱球菌病的發(fā)生率較低［14］。在美國(guó)，加利福尼亞州每年免疫功能正常者的隱球菌病發(fā)病率為0.2／10萬［22］，佐治亞州的亞特蘭大為0.9／10萬，阿拉巴馬州為0.93／10萬［19］。此次我們只分析了129株新型隱球菌臨床株，因此難以確定VNⅠc基因亞型新型隱球菌在我國(guó)分布是否最廣泛，如對(duì)環(huán)境株大量分離并進(jìn)行類似的基因分型，將有利于更深入地了解VNⅠc型在中國(guó)的分布，進(jìn)一步探索VNⅠc型新型隱球菌在無明顯免疫缺陷人群感染過程中的意義。

東南亞分布最廣的格特隱球菌基因型是VGⅠ，此次從我國(guó)東南部分離到的格特隱球菌主要為VGⅠ型再次證明以上結(jié)論。此次研究中格特隱球菌菌株只有9株，數(shù)量較少，但其在艾滋病相關(guān)隱球菌感染者中占的比例高于預(yù)期，國(guó)外學(xué)者報(bào)道，除非洲某些地區(qū)外，格特隱球菌很難從艾滋病患者身上分離到［14］，澳大利亞格特隱球菌分布廣泛，但從新型隱球病合并艾滋病患者身上分離到的臨床株中，47株中只有1株是格特隱球菌［21］。

在我們前期研究中，分離到1株尿素酶陰性的B－4578臨床株，在小鼠身上進(jìn)行的毒力研究顯示，其與標(biāo)準(zhǔn)株99的高致病性相當(dāng)［23］，而B－4578臨床株也是VNⅠc型，故推測(cè)我國(guó)VNⅠc型可能具有與標(biāo)準(zhǔn)株99相似的高致病性。小鼠毒力研究顯示，3株來自中國(guó)不同省份VNⅠc型臨床株的致病性比VNⅠ更高，但低于標(biāo)準(zhǔn)株99，這表明不同的VNⅠc型菌株對(duì)動(dòng)物致病性存在明顯差異，新型隱球菌對(duì)人類和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是否有相同程度的致病性目前尚不明確，本研究結(jié)果與美國(guó)12株在動(dòng)物和人體的致病性無明顯的相關(guān)性［24］，在BALB／c小鼠身上，美國(guó)12株是致命性最強(qiáng)的血清D型菌株之一，但是它只引起人類局部慢性感染，并不擴(kuò)散，經(jīng)兩性霉素B治療后基本無傳播或復(fù)發(fā)。

有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，澳大利亞的原住民新型隱球菌感染率高于白種人［25］，洛杉磯也曾報(bào)道西班牙裔美國(guó)人新型隱球菌感染率是白人的2倍［26］，此次129株新型隱球菌臨床株均來自中國(guó)大陸患者，是否存在類似上述的種族差異有待進(jìn)一步研究。流行病學(xué)分析顯示我國(guó)大部分臨床株分離自非艾滋病患者，可能與分離到菌株的患者來源也有一定的關(guān)系，雖有部分新型隱菌病患者來自河南、云南、新疆等艾滋病發(fā)病率較高省份，大部分患者來自艾滋病感染率較低的省市。此外，在我國(guó)，患者一旦查出HIV血清陽性，將很快隔離，國(guó)內(nèi)外對(duì)艾滋病患者的處理方式差異是否為感染人群差異的重要原因，我們下一步將開展更深入的研究，進(jìn)一步明確。

綜上所述，此研究揭示了我國(guó)新型隱球菌驚人的遺傳同質(zhì)性，血清A型新型隱球菌主要基因型為VNⅠc，血清B型格特隱球菌主要基因型為VGⅠ，且我國(guó)無明顯免疫缺陷人群新型隱球菌高發(fā)病率與國(guó)外報(bào)道形成明顯的對(duì)比，基因亞型的不同可能是導(dǎo)致我國(guó)與其他國(guó)家地區(qū)新型隱球菌感染人群差異的重要因素。

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