陳惠玲，盛 慧，葉惠芬，楊英為，楊一言，黃小媛，楊銀梅

銅綠假單胞菌是醫(yī)院感染的重要病原菌，其致感染機(jī)制是通過(guò)Ⅲ型分泌系統(tǒng)（typeⅢsecretion system，T3SS），以其效應(yīng)蛋白ExoU為主的毒力蛋白表達(dá)，可導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的凋亡，加重炎性反應(yīng)，增高感染病死率［1］。攜帶毒力基因的泛耐藥銅綠假單胞菌，給臨床銅綠假單胞菌感染的治療帶來(lái)了極大挑戰(zhàn)。因此，本研究對(duì)53株臨床分離的泛耐藥銅綠假單胞菌進(jìn)行毒力基因exoU和exoS檢測(cè)，并采用BOX－PCR指紋圖譜分析技術(shù)對(duì)醫(yī)院感染的泛耐藥銅綠假單胞菌進(jìn)行同源性分析，為醫(yī)院感染的控制與管理提供基因分型的病原學(xué)資料，為臨床抗感染治療提供依據(jù)。

材料與方法

一、材料

（一）菌株來(lái)源及分布 53株泛耐藥銅綠假單胞菌分離自2008年9月—2012年6月廣州市第一民醫(yī)院醫(yī)院感染患者的各種臨床標(biāo)本，剔除同一患者相同部位在1周內(nèi)檢出的重復(fù)菌株。其中纖維支氣管鏡吸痰標(biāo)本42株，傷口分泌物和中段尿標(biāo)本各3株，靜脈血標(biāo)本2株，腹水、膿液和膽汁各1株。菌株主要分布于重癥監(jiān)護(hù)病房27株，呼吸內(nèi)科11株，綜合病科7株，急診留觀病區(qū)和腦系外科各2株，血液內(nèi)科、燒傷外科、胃腸外科和鶴洞分院內(nèi)科各1株。

（二）儀器與試劑 VITEK2系統(tǒng)及API20E試劑均為法國(guó)生物梅里埃公司產(chǎn)品；PCR儀為美國(guó)PE公司產(chǎn)品；電泳儀為美國(guó)BIO－RAD公司產(chǎn)品；成像系統(tǒng)為英國(guó)UVI凝膠成像系統(tǒng)；引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成；Premix Taq酶（Code No.：D334A）體系及 DNA Marker DL2000購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。

二、方法

（一）細(xì)菌鑒定及藥物敏感試驗(yàn) 采用常規(guī)方法分離細(xì)菌，用API 20NE或法國(guó)生物梅里埃公司VITEK2系統(tǒng)進(jìn)行菌種鑒定且進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)，結(jié)果參照CLSI 2009年版標(biāo)準(zhǔn)判讀［2］。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌 ATCC 25922、銅綠假單胞菌 ATCC 27853。

（二）統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用WHONET5.6軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

（三）細(xì)菌DNA的提取 采用煮沸法提取細(xì)菌總DNA，挑取一定量純培養(yǎng)菌落加入含適量蒸餾水的 EP管中，混勻后加熱煮沸，10 000 r／min冷凍離心2 min。另取1.5 mL的EP管，將離心后的上清液吸入新的EP管中，上清液即為細(xì)菌總DNA溶液，保存于－20℃冰箱中備用。

（四）PCR檢測(cè) 毒力基因exoS和exoU采用PCR法檢測(cè)，Premix Taq酶體系25μL，上下游引物各10 pmol，模板DNA4μL，用ddH2O補(bǔ)足至50μL。循環(huán)參數(shù)為，94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，62℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)，最后于72℃延伸10 min。取8μL PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析，采用凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄結(jié)果。毒力基因引物序列和目的產(chǎn)物長(zhǎng)度見(jiàn)表1。

（五）BOX－PCR檢測(cè)攜帶相關(guān)毒力基因菌株同源性 BOX－PCR引物BoxAR1序列為5′－CTACGGCAAGGCGACGCTGACG－3′［3］。BOX－PCR 反應(yīng)體系總體積為25μL，包括 Premix Taq 12.5μL、DNA模板1μL、引物1μL、滅菌蒸餾水補(bǔ)足至25μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性45 s，50℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)，最后于72℃延伸7 min。取8μL PCR產(chǎn)物，加2μL溴酚藍(lán)于80V電壓，2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳1 h后，0.5 mg／L溴乙錠溶液染色成像，采用凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄結(jié)果。應(yīng)用Quantity one軟件中的非加權(quán)配對(duì)算數(shù)平均法（UPGMA）構(gòu)建聚類(lèi)分析圖，把相似度大于80%菌株劃分為同一個(gè)基因型，代表同一克隆株，相似度小于80%菌株為不同的基因型，代表不同的克隆株。

表1 檢測(cè)銅綠假單胞菌毒力基因exo U和exo S的引物Table 1 Sequence of the primers used for PCR amplification of virulence genes exoUand exoSin Pseudomonas aeruginosa

結(jié) 果

一、藥敏試驗(yàn)

53株銅綠假單胞菌對(duì)抗菌藥物阿米卡星、頭孢他啶、頭孢曲松、環(huán)丙沙星、慶大霉素、亞胺培南、妥布霉素、頭孢吡肟、左氧氟沙星、甲氧芐啶－磺胺甲口惡唑、哌拉西林－他唑巴坦、氨曲南均耐藥。

二、菌株毒力基因exoS和exoU檢測(cè)

電泳結(jié)果顯示，53株泛耐藥銅綠假單胞菌中，41株菌毒力基因exo S陽(yáng)性，11株菌毒力基因exo U陽(yáng)性。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)，其中40株為exo S＋／exo U－表型，占75.5%；10株為exo U＋／exo S－表型，占18.9%；1株為exo S＋／exo U＋表型，占1.9%；2株為exo S－／exo U－表型，占3.8%。exo S＋／exo U－和exo U＋／exo S－型主要分布在重癥監(jiān)護(hù)病房，分別為16株（16／40，40%）和8株（8／10，80%）。

三、攜帶相關(guān)毒力基因菌株同源性比較

部分BOX－PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜見(jiàn)圖1。BOX－PCR和聚類(lèi)圖軟件分析顯示，11株exoU＋的菌株可劃分為7個(gè)基因型，分別命名為U1～U7，41株exoS＋的菌株可劃分為24個(gè)基因型，分別命名為S1～S24。其中主要的基因型有U7、S12、S14、S22和S24型，見(jiàn)表2。U7型克隆3株，來(lái)源于2個(gè)不同的科室；S12和S14型克隆各3株，S22型克隆4株，均分別來(lái)源于3個(gè)不同的科室；S24型克隆4株，來(lái)源于呼吸內(nèi)科，其余均為獨(dú)立的基因型。

圖1 泛耐藥銅綠假單胞菌部分?jǐn)U增產(chǎn)物電泳圖Figure 1 Electrophoretic result of BOX－PCR in some pandrug－resistant Pseudomonas aeruginose strains

表2 泛耐藥銅綠假單胞菌BOX－PCR主要基因型的科室及毒力基因分布Table 2 Distribution of the BOX－PCR－based virulence genotypes of pandrug－resistant Pseudomonas aeruginosain different wards

討 論

銅綠假單胞菌是醫(yī)院感染的重要病原菌，常呈多重耐藥或泛耐藥，治療棘手，病死率高，可造成一定程度的醫(yī)院感染流行［4－5］，因此泛耐藥銅綠假單胞菌為醫(yī)院感染的主要監(jiān)控對(duì)象。自1996年我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)分離到第1株泛耐藥銅綠假單胞菌以來(lái)，世界上多個(gè)地區(qū)陸續(xù)有泛耐藥銅綠假單胞菌的報(bào)道［5］，我院3年多分離到53株泛耐藥銅綠假單胞菌，主要分布在重癥監(jiān)護(hù)病房和呼吸內(nèi)科，與這2個(gè)科室常年收治大量需機(jī)械通氣的危重患者，且大部分患者有嚴(yán)重的基礎(chǔ)疾病，免疫功能低下，頻繁使用留置導(dǎo)管等侵襲性操作有關(guān)。

T3SS是銅綠假單胞菌致病性的重要毒力系統(tǒng)，其中exoS和exoU的臨床意義尤為重要，Hauser等［6］研究顯示，exoU＋為細(xì)胞毒型基因，表達(dá)蛋白ExoU引起細(xì)胞壞死、凋亡，危害最大；exo S＋為侵襲型基因，表達(dá)蛋白exoS能抑制宿主細(xì)胞吞噬作用、破壞肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重排、導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞分裂等，感染相對(duì)較輕；exoU＋基因型的銅綠假單胞菌毒力更強(qiáng)，感染后癥狀更嚴(yán)重，患者病死率更高；T3SS陽(yáng)性銅綠假單胞菌常以exo S＋／exo U－和exo U＋／exo S－基因型存在。本研究結(jié)果顯示，53株泛耐藥銅綠假單胞菌中，exo S＋／exo U－基因型菌40株，占75.5%；exo U＋／exo S－基因型菌10株，占18.9%，與卓超等［7］報(bào)道相似。另有1株為exo S＋／exo U＋表型，2株為exo S－／exo U－表型。攜帶毒力基因的銅綠假單胞菌主要分布在重癥監(jiān)護(hù)病房，以exo S＋／exo U－和exo U＋／exo S－基因型為主，且在重癥監(jiān)護(hù)病房exo U＋／exo S－基因型菌株的分離株為8株（8／10），明顯高于分離率為40%（16／40）的exo S＋／exo U－基因型。因此，對(duì)于攜帶毒力基因的泛耐藥銅綠假單胞菌，更應(yīng)加強(qiáng)監(jiān)控，防止醫(yī)院感染暴發(fā)流行。

BOX插入因子為細(xì)菌基因組重復(fù)序列，大小為154 bp，由保守性不同的box A、box B和boxC等亞單位組成，其中只有box A存在細(xì)菌菌株、種、屬水平的分布差異及進(jìn)化過(guò)程中表現(xiàn)出多拷貝和高保守性，BOX－PCR技術(shù)則根據(jù)box A亞單位設(shè)計(jì)引物，使重復(fù)序列之間的不同基因區(qū)域得以選擇性擴(kuò)增，得到大小不等的DNA擴(kuò)增片段，最后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其多態(tài)性［3，8］。

BOX－PCR結(jié)果顯示，exoU＋菌株中，3株U7型克隆株來(lái)源于2個(gè)不同的科室，結(jié)合臨床資料，3株菌分離的時(shí)間相差較遠(yuǎn)，可排除該克隆株的院內(nèi)暴發(fā)流行。exoS＋菌株中，4株S24型克隆株均來(lái)源于呼吸內(nèi)科，雖是同年不同月份分離，仍提示S24型克隆株在呼吸內(nèi)科存在流行。因此，應(yīng)嚴(yán)格進(jìn)行消毒隔離，以避免該克隆株在科室，甚至醫(yī)院發(fā)生暴發(fā)流行。S12、S14型克隆各3株，S22型克隆4株，均來(lái)源于3個(gè)不同科室，且S14和S22型克隆株分離的時(shí)間相隔較遠(yuǎn)，故不存在這2型克隆株的院內(nèi)暴發(fā)流行，而S12型克隆株在同1個(gè)月發(fā)現(xiàn)，說(shuō)明其在醫(yī)院內(nèi)存在小規(guī)模的流行?？咕幬锏拇罅渴褂檬菍?dǎo)致泛耐藥銅綠假單胞菌形成的主要原因，機(jī)械通氣等頻繁應(yīng)用的侵襲性治療手段容易因消毒不嚴(yán)格而導(dǎo)致泛耐藥銅綠假單胞菌的傳播，入住重癥監(jiān)護(hù)病房時(shí)間過(guò)長(zhǎng)患者因病情嚴(yán)重，需接受更多的抗菌藥物及侵襲性治療措施，也易受泛耐藥銅綠假單胞菌感染［5，9］。3株S12型克隆株分別來(lái)源于重癥監(jiān)護(hù)病房、綜合病科和呼吸內(nèi)科，提示這些科室應(yīng)加強(qiáng)醫(yī)院感染的控制，合理應(yīng)用抗菌藥物，隔離感染的患者，加強(qiáng)醫(yī)護(hù)人員手衛(wèi)生和其他消毒隔離措施，并用BOX－PCR技術(shù)對(duì)泛耐藥銅綠假單胞菌感染進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，以防止暴發(fā)流行。

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