喻 鳳，竇全文

(1.中國科學(xué)院西北高原生物研究所高原生物適應(yīng)與進(jìn)化重點實驗室，青海 西寧 810001;2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

紫花苜蓿(Medicago sativa L.，2n=4x=32)是豆科蝶形花亞科苜蓿屬多年生草本植物［1-2］。由于其具有耐干旱、耐貧瘠、耐冷熱、產(chǎn)量高而質(zhì)優(yōu)、營養(yǎng)豐富等多種特點，常被冠以“牧草之王”的美譽，廣泛種植于西北、華北、東北等地區(qū)，是中國栽培面積最大的牧草［3］。此外苜蓿同時又是蔬菜、蜜源、肥田、固氮、保持水土并調(diào)節(jié)生態(tài)環(huán)境等多功能合一不可多得的寶貴植物［4］。

苜蓿的染色體較小，在根尖細(xì)胞中的長度僅為2～3 μm，且大多數(shù)為中部著絲粒染色體，形態(tài)相似，很難區(qū)分。許多學(xué)者［5-9］對苜蓿的不同栽培品種及其亞種的核型進(jìn)行過研究，準(zhǔn)確地確定了不同品種的染色體數(shù)，建立了相關(guān)的核型公式，但均因缺乏穩(wěn)定可用的細(xì)胞學(xué)標(biāo)記，僅根據(jù)形態(tài)特征區(qū)分染色體，致使染色體配對和測量難以準(zhǔn)確。此外，學(xué)者們也有根據(jù)C-帶［10］、DAPI-帶［11］以及混合的 Cot-1DNA 帶［12］對苜蓿的同源染色體進(jìn)行了較精確的配對，但均未能對染色體上各分帶中的分子特性提供直接有力的證據(jù)。到目前為止，僅有核糖體DNA作為已知分子信息的探針被反復(fù)應(yīng)用于四倍體苜蓿的分子細(xì)胞遺傳學(xué)標(biāo)記中［11-13］。因此，苜蓿準(zhǔn)確而穩(wěn)定的分子細(xì)胞學(xué)核型的建立急切需要更多可識別的分子細(xì)胞學(xué)標(biāo)記。

熒光原位雜交(FISH)是將標(biāo)記的DNA序列定位在染色體或染色質(zhì)上的一種有效而精準(zhǔn)的分子細(xì)胞遺傳學(xué)方法。通過FISH將核糖體基因和特異性重復(fù)序列在染色體上進(jìn)行物理定位，不僅可以為核型分析提供穩(wěn)定有效的可識別的細(xì)胞學(xué)染色體標(biāo)記，而且可以用于研究多倍體植物物種的起源進(jìn)化、基因組組分的分析、細(xì)胞學(xué)遺傳圖譜的構(gòu)建、染色體的結(jié)構(gòu)變異的檢測、基因工程育種等重要的遺傳學(xué)問題［14-17］。E180 重復(fù)序列是 Xia 等［18］于 1993 年在紫花苜蓿中通過酶切消化全基因組克隆到的1個750 bp長的DNA片段，Southern雜交和序列分析顯示該片段是以185～188 bp堿基為重復(fù)單元組成的高度串聯(lián)重復(fù)序列。

本研究通過設(shè)計引物對E180序列進(jìn)行PCR擴增，再次獲得該片段，首次將該串聯(lián)重復(fù)序列作為探針結(jié)合45S核糖體基因?qū)煞N常用的栽培紫花苜蓿品種進(jìn)行雙色FISH定位，并分析比較其熒光分帶，為兩種重要的栽培紫花苜蓿種質(zhì)資源的區(qū)分、建立詳細(xì)的分子細(xì)胞遺傳學(xué)圖譜和測序工作的進(jìn)一步開展提供了可靠的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

紫花苜蓿栽培品種金皇后和中苜1號均由種子公司直接購買。

1.2 染色體制片

將不同材料的種子放于濕潤的濾紙上，室溫下發(fā)芽。待根尖長至約2 cm時，取出植株于0～4℃冰水中處理24 h。用卡諾液固定30 min以上，取根尖分生區(qū)部分，45%醋酸火焰干燥壓片，相差顯微鏡觀察，選取中期分裂良好的制片冰凍揭片。

1.3 E180片段的獲得

運用Primer Premier 5.0軟件對已發(fā)表的750 bp E180片段設(shè)計引物，上引物序列為:5'-CATGCTTCGATTCGATAAG-3'，下引物序列為:5'-GGGTTAAGTGAATTTCCTTG-3'。用 Nagaki等［19］于 1995 年描述的兩步PCR程序?qū)180串聯(lián)重復(fù)序列進(jìn)行擴增。將擴增的PCR產(chǎn)物富集后，對亮帶進(jìn)行膠回收并進(jìn)行測序。

1.4 探針標(biāo)記

用日本鳥取大學(xué)Tsujimoto教授提供的含有45 S核糖體基因片段的質(zhì)粒pWrrn和膠回收后的E180片段分別作為探針制備模板。質(zhì)粒pWrrn(含45 rDNA)通過缺口平移法用紅色Tetramethyl-rhodamine-5-dUTP進(jìn)行標(biāo)記;E180片段通過隨機引物法用綠色Flurescein-12-dUTP進(jìn)行標(biāo)記。

1.5 熒光原位雜交及信號檢測

染色體制片在0.2 mol/L NaOH溶液中室溫變性10 min后，用-20℃無水乙醇固定。每張制片雜交液為10 μl，其中含有50% 甲酰胺、50%硫酸葡聚糖、1 mg鮭魚精 DNA、1 μl 20×SSC 和10 ng探針DNA。雜交液在90～92℃變性5 min后，與變性后的制片在37℃下雜交20～24 h。雜交后的制片用雙蒸水沖洗，利用含 DAPI(4，6-diamidino-2-phenylindole)的抗熒光衰減封片劑(Vector)封片。用Leica熒光顯微鏡觀察(每個材料觀察5個細(xì)胞)，利用 CCD(Cool snapper，Photometrics)獲取圖像，利用Photoshop 5.0進(jìn)行圖像后期處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 E180片段的獲得

對E180序列設(shè)計引物，引物擴增的目標(biāo)片段大小為108 bp。以中苜1號基因組為模板，用兩步PCR程序?qū)180片段進(jìn)行擴增。擴增結(jié)果(圖1)顯示，擴增產(chǎn)物主要為大小不等的彌散條帶，且彌散帶在1500 bp以下可見規(guī)律性的亮帶集中分布，其中300 bp處的條帶最亮，100 bp和500 bp處次之，500 bp以上隱約可見較弱的主帶分布;約100 bp處的亮帶被認(rèn)為是108 bp大小的引物目標(biāo)片段，約300 bp處的亮帶被認(rèn)為是108 bp的目標(biāo)片段加上1個E180重復(fù)單元(約185～188 bp)的片段，約500 bp處的亮帶被認(rèn)為是108 bp的目標(biāo)片段加上2個E180重復(fù)單元的片段。將最小的亮帶進(jìn)行膠回收后測序，并將該測序結(jié)果與原始的E180序列進(jìn)行比對分析。序列比對結(jié)果(圖2)顯示，PCR擴增的片段相對于原始的E180序列具有2個堿基的缺失和1個堿基的突變。該結(jié)果表明E180序列在中苜1號中也呈串聯(lián)重復(fù)分布，可作為很好的熒光原位雜交探針使用。

圖1 E180 PCR擴增結(jié)果Fig.1 The PCR amplification of E180 repetitive sequence

圖2 E180片段原始序列和擴增片段測序結(jié)果Fig.2 Comparison of sequences between E180 original fragment and PCR amplified fragment

2.2 E180和45S rDNA的雙色FISH定位

利用綠色E180探針和紅色45S核糖體基因探針對2種紫花苜蓿染色體制片進(jìn)行雙色熒光原位雜交定位。熒光帶型分析結(jié)果表明45S核糖體基因在2個材料中都表現(xiàn)為4條染色體上有雜交信號;E180雜交信號在金皇后和中苜1號體細(xì)胞的絕大多數(shù)染色體上的都有分布，主要集中分布于染色體近著絲粒區(qū)和近端部部位，且各染色體之間表現(xiàn)出了明顯可見的多態(tài)性雜交信號(圖3)。

2.3 染色體熒光分帶分析

根據(jù)E180和45 S rDNA 2種雜交信號在染色體上的不同分布特征，對2種紫花苜蓿的32條染色體進(jìn)行了同源染色體配對分析，并對2種物種染色體上的信號特征進(jìn)行統(tǒng)計，嘗試建立該物種的分子核型(圖3，表1)。結(jié)果表明2種紫花苜蓿的絕大多數(shù)染色體的同源染色體(11～13對)都能得到清晰可靠的辨別。根據(jù)特征性雜交信號的分布，16對染色體主要可以區(qū)分為以下幾種類型(因多條染色體的雜交信號在2種品種間呈多態(tài)性，此類型僅以中苜1號為標(biāo)準(zhǔn)劃分):a型，無45S雜交信號，無E180雜交信號(1號染色體);b型，長臂具有45S雜交信號，長臂和短臂近著絲粒區(qū)具有E180雜交信號(2號染色體);c型，長臂具有45S雜交信號，著絲粒區(qū)具有E180雜交信號，短臂無雜交信號(3號染色體);d型，短臂中間區(qū)具有E180雜交信號，長臂無雜交信號(4、8、15和16號染色體);e型，短臂近端粒區(qū)和著絲粒區(qū)具有E180雜交信號，長臂無雜交信號(5號和11號染色體);f型，長臂近著絲粒區(qū)具有E180雜交信號，短臂無雜交信號(6號染色體);g型，短臂中間區(qū)和著絲粒區(qū)具有E180雜交信號，長臂無雜交信號(7號染色體);h型，短臂中間區(qū)和長臂近著絲粒區(qū)具有E180雜交信號(9號染色體);i型，短臂近端粒區(qū)和長臂近著絲粒區(qū)具有E180雜交信號(10號染色體);j型，長臂中間區(qū)具有著絲粒信號，短臂無雜交信號(12號染色體);k型，短臂近端粒區(qū)具有E180雜交信號，長臂無雜交信號(13號染色體);l型，短臂中間區(qū)和長臂中間區(qū)具有E180雜交信號(14號染色體)。在12種雜交信號的分布類型中，僅在d型和e型中發(fā)現(xiàn)了具有相似信號分布的染色體:4號、8號、15號和16號染色體具有相似的信號分布，5號和11號染色體具有相似的信號分布，其余信號分布類型中都只有唯一的染色體存在。

圖3 兩種紫花苜蓿的FISH結(jié)果和核型分析Fig.3 FISH patterns and molecular karyotypes of two M.sativa species

2.4 2個紫花苜蓿品種之間同源染色體的不同分布特征

比較2種探針在不同紫花苜蓿材料各同源染色體上的分布特征，結(jié)果如表1所示。2種紫花苜蓿的45 S雜交信號都被定位于2號和3號染色體的長臂端，而2種紫花苜蓿的E180雜交信號在12對染色體上呈現(xiàn)一致分布，在6對染色體上呈現(xiàn)出不同的雜交信號。1號染色體:在中苜1號中沒有檢測到任何雜交信號，在金皇后的著絲粒區(qū)檢測到了E180雜交信號;4號染色體:在中苜1號的短臂中間區(qū)檢測到E180雜交信號，在金皇后的短臂近端粒區(qū)檢測到了E180雜交信號;5號染色體:在中苜1號短臂的近端粒區(qū)和著絲粒區(qū)檢測到了E180雜交信號，在金皇后短臂的近端粒區(qū)和長臂的近著絲粒區(qū)檢測到了E180雜交信號;8號染色體:在中苜1號短臂的中間區(qū)檢測到了E180雜交信號，在金皇后短臂的中間區(qū)和長臂的近著絲粒區(qū)檢測到了E180雜交信號;15號染色體:在中苜1號短臂的中間區(qū)檢測到了E180雜交信號，在金皇后短臂的近端粒區(qū)和長臂的近著絲粒區(qū)檢測到了E180雜交信號;16號染色體:在中苜1號短臂的中間區(qū)檢測到了E180雜交信號，在金皇后短臂的中間區(qū)和長臂的近著絲粒區(qū)檢測到了E180雜交信號。

3 討論

真核生物的核糖體基因是一個串聯(lián)的多基因家族，該基因被認(rèn)為在植物進(jìn)化過程中是相當(dāng)保守的基因，在染色體組中通常以1對或幾對染色體分布，物理位置比較保守［20］。竇全文等［21］利用45S核糖體基因探針對多種四倍體苜蓿染色體制片進(jìn)行FISH定位，結(jié)果表明所有材料的4條染色體上均有45S核糖體基因雜交信號，本試驗中所用的2個材料的信號分布與此相符。各種重復(fù)DNA序列的物理定位可以用原位雜交技術(shù)分析染色體或染色質(zhì)的分子特性，以串聯(lián)重復(fù)DNA序列為探針的原位雜交還可以用于分子細(xì)胞圖譜的構(gòu)建［22］。Xia等［18］于1993年報道E180是富含“AT”堿基的串聯(lián)重復(fù)序列。本試驗以E180為探針對苜蓿染色體進(jìn)行熒光原位雜交的結(jié)果顯示苜蓿的大部分染色體的近端部和近著絲粒區(qū)都屬于“AT”豐富區(qū)，詳細(xì)地將E180重復(fù)序列在苜?？偦蚪M上的分布進(jìn)行了定位，可以為苜?；蚪M學(xué)研究提供部分參考信息。

表1 2種紫花苜蓿染色體熒光分帶特征分析Table 1 Fluorescence patterns in two Medicago sativa species

染色體核型分析是對生物體細(xì)胞核內(nèi)全部染色體的形態(tài)特征進(jìn)行分析，是遺傳學(xué)研究的重要手段，也是物種分類和物種鑒定的基本依據(jù)［23］。Bauchan等［24］應(yīng)用C-帶分型和形態(tài)分析構(gòu)建出了四倍體苜蓿的核型圖，他們的研究結(jié)果顯示苜?；蚪M中有4套相似的染色體組，每套染色體中有8個染色體。然而，由于C-帶技術(shù)的復(fù)雜程度阻礙了該技術(shù)在不同實驗室間的應(yīng)用。本試驗中所用的熒光原位雜交技術(shù)是染色體分析的一個強有力工具，它不僅可以對標(biāo)記的染色體進(jìn)行區(qū)分還可以直接提供染色體上的分子信息。在染色體熒光分帶分析中，我們根據(jù)雜交信號的分布，將苜蓿的16對染色體區(qū)分為了12種類型，而不是8種類型，這與C-帶中提出的苜?；蚪M中有4套相似的染色體組不相符，提示同源四倍體的苜蓿部分染色體已有分化的趨勢。

中苜1號是由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所培育成功的耐鹽苜蓿品種，而金皇后是從美國進(jìn)口的紫花苜蓿品種，兩者在來源上有很大的差別。本研究對2品種的FISH結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)中苜1號和金皇后的同源染色體組成間存在明顯的染色體變異，這種變異可能是由于苜蓿的異交特性造成的，也可能是育種過程中人工選擇的結(jié)果。了解不同品種染色體之間的多樣性，會增加育種工作的目的性。本研究結(jié)果表明E180的FISH定位不僅可以進(jìn)一步了解苜蓿染色體組的分子特性，還可以作為一個穩(wěn)定可靠的染色體新標(biāo)記被推廣應(yīng)用于苜蓿屬植物的細(xì)胞學(xué)研究中，為苜蓿屬植物的物種起源、系統(tǒng)分類與進(jìn)化、基因組學(xué)研究等方面的研究提供穩(wěn)定可靠的新依據(jù)。

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