于 游 張才全

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外科，重慶 400016)

Id蛋白，又稱為分化抑制因子(Id)，從屬于 bHLH(helix- loop-helix，HLH)轉(zhuǎn)錄因子家族〔1〕。Id1分子是新的準原癌基因，在多種腫瘤中有異常的表達，參與了腫瘤細胞增殖、凋亡、浸潤、遷移以及腫瘤血管生成等多方面相關(guān)行為的調(diào)控，其參與腫瘤發(fā)生和進展的機制尚不完全清楚，但鑒于Id1在腫瘤多個環(huán)節(jié)中的作用，并且在成體組織中幾乎不表達，Id1成為一個很有潛力的新的腫瘤治療靶點〔2〕。Id1在結(jié)腸癌組織中表達明顯高于正常組織及結(jié)腸癌旁組織〔3〕，故研究Id1與結(jié)腸癌的關(guān)系，對于進一步闡明結(jié)腸癌的生物學(xué)行為以及治療將會有積極意義。本研究在體外過表達及抑表達Id1情況下檢測結(jié)腸癌HT-29細胞VEGF mRNA和蛋白的表達情況以及腫瘤細胞增殖情況，以探討Id1在結(jié)腸癌細胞增殖中的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要試劑 HT-29(人結(jié)腸癌細胞，中科院上海細胞庫提供);Id1一抗購于Miliipore公司;GAPDH一抗購于santa cruz公司;山羊抗兔二抗購于北京中杉生物有限公司;RNA提取試劑盒購于Takara公司;RT-PCR試劑盒購自Tiangen公司;Trisbase購于上海生工生物工程有限公司;EXTaq酶購于Takara公司;dNTP購于Takara公司;VEGF一抗購于Miliipore公司;脂質(zhì)體Lipofect amine 2000購于Invitrogen公司;Id1基因的特異性小干擾RNA(siRNA)Si-Id-1-001(19 bp)〔4〕由廣州銳博生物公司設(shè)計與合成，各自的正義和反義序列分別為:正義鏈5'-UGA GCA AGG UGG AGA UUCU dTdT－3'，反義鏈 3'-dT-dT ACU CGU UCC ACCU CUA AGA-5'。

1.2 細胞培養(yǎng)與Id1過表達及抑表達質(zhì)粒構(gòu)建及轉(zhuǎn)染 人結(jié)腸癌細胞株HT-29經(jīng)復(fù)蘇后，常規(guī)培養(yǎng)于含10%新生小牛血清，青霉素(100 U/ml)，鏈霉素(100μg/ml)的RPMI1640培養(yǎng)基中。Id1全長基因擴增 Id1:上游引物:5'TAACTGTTCCATTTTCCGTA 3'，下游引物:5'TTACCACCATCTAAATTATTTG 3'擴增長度:975 bp，退火溫度:60℃，采用Pfu保真酶擴增。PCR擴增Id1片段，利用限制性內(nèi)切酶EcoR I和NotI將其連接至載體pGEx-4T-1，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取單菌落，提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR和雙酶切鑒定后測序。轉(zhuǎn)染前1 d，將2.5×105個細胞/孔接種于6孔培養(yǎng)板，過表達實驗分為以下3組:空白組、對照組(空載體組)、過表達組;抑表達實驗分為以下3組:空白組、對照組(空載體組)、抑表達組。各組均在37℃，1%O2，99%N2，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h后進行轉(zhuǎn)染，染實驗參照Lipofectamine 2000產(chǎn)品說明書進行操作。待細胞轉(zhuǎn)染48 h后，分別用TRizol和RIPA裂解液提取細胞總 RNA和細胞總蛋白。

1.3 RT-PCR檢測Id1、VEGF mRNA 參照Trizol試劑盒說明書提取各組細胞總的RNA。Id1上游引物:5'CTGAGGCACTGGCGAGGAGA3'，下游引物，5'GAGAAGCACCAAACGTGACCAT 3'，擴增長度:140 bp，退火溫度:59℃。GAPDH上游引物:5'ACCCACTCCTCCACCTTTGA 3'，下游引物:5'ACCACCCTGTTGCTGTAGCC 3'，擴增長度:107 bp，退火溫度:58℃。VEGF上游引物:5'GGGCAGAATCATCACGAAGT 3'，下游引物:5'GATGTACTCGATCTCATCAGGGT 3'，擴增長度:117 bp，退火溫度:60℃。反應(yīng)體系:1×PCR Buffer，dNTP 0.2 mmol/L，cDNA 模板200 ng，引物濃度 0.4 μmol/L，Taq 酶 1.25 U，反應(yīng)總體積25μl。按照RT-PCR試劑盒進行PCR擴增:1μl DNA樣本作為PCR擴增模板，陰性對照擴增模板為去離子水;擴增條件為95℃預(yù)變性2 min;隨后95℃10 s，退火溫度15 s，72℃ 延伸45 s，共40個循環(huán);最后72℃延伸10 min。實驗重復(fù)3次，取其平均值。

1.4 Western印跡檢測Id1、VEGF蛋白 用RIPA裂解液提取各組細胞總蛋白后，用Western印跡檢測Id1、VEGF蛋白。每106個細胞加入500μl細胞裂解液，冰上放置30 min裂解細胞，12 000 r/min離心20 min，收集上清液，測定提取的總蛋白濃度。取等量蛋白樣品50 g進行8%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，以GAPDH/Lamin蛋白作為等量蛋白質(zhì)上樣對照。然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，經(jīng)5%脫脂奶粉封閉，分別與Id1、VEGF多克隆抗體(濃度為1∶1 500)4℃反應(yīng)過夜及相應(yīng)的羊抗兔二抗(濃度為1∶3 000)反應(yīng)，加入化學(xué)發(fā)光劑ECL反應(yīng)，顯色，密度掃描分析。實驗重復(fù)3次，取其平均值。

1.5 MTT實驗 取各組對數(shù)生長期的HT-29細胞，以每孔103接種于96孔板內(nèi)，加入條件培養(yǎng)基。在第1～8天，每天每種條件培養(yǎng)基的細胞各取出3孔加入MTT溶液(5 g/L)20μl，繼續(xù)37℃孵育4 h后，吸棄培養(yǎng)上清，加入DMSO 150μl，振蕩10 min。在ELISA檢測儀上測定各孔的A490 nm值。以時間為橫坐標，3復(fù)孔的平均光吸收值為縱坐標，繪制HT-29細胞生長曲線。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料以x±s表示，采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 Id1過表達驗證 采用Western印跡法檢測空白組、對照組(空載體組)、過表達組 Id1/GAPDH蛋白分別為:0.287±0.031 4、0.320±0.047 6、0.845±0.138 0，相對于對照組(空載體組)，Id1過表達組Id1蛋白表達明顯增加(P＜0.01)，Western印跡見圖1，證實Id1過表達成功。

圖1 Id1過表達對Id1蛋白表達的影響

2.2 過表達后各組VEGF mRNA和蛋白表達變化 轉(zhuǎn)染Id1表達質(zhì)粒后采用RT-PCR法檢測空白組、對照組(空載體組)、過表達組VEGF/GAPDH mRNA分別為:0.002 99±0.000 687、0.003 49±0.001 34、0.031 3±0.006 05。采用 Western印跡法檢測空白組、對照組(空載體組)、過表達組VEGF/GAPDH蛋白分別為:0.132±0.035 1、0.131±0.053 0、0.245±0.032 6，Western印跡見圖2。相對于對照組(空載體組)，Id1過表達組VEGF mRNA、蛋白表達明顯增加(P＜0.01)。

2.3 過表達后各組MTT結(jié)果 培養(yǎng)第1天，各組間吸光度(OD值)相比無顯著性差別(P＞0.05);培養(yǎng)至第2天起，過表達組增殖活性增強(P＜0.05)，從培養(yǎng)第3天這種差別越明顯(P＜0.01)，提示轉(zhuǎn)染Id1過表達質(zhì)粒后對細胞的增殖活有明顯影響;轉(zhuǎn)染空白組與對照組的生長曲線非常接近，說明其增殖活性不受影響。見表1，生長曲線見圖3。

圖2 Id1過表達對VEGF蛋白表達的影響

表1 Id1過表達各組MTT法各組OD值(x±s)

圖3 過表達各組生長曲線

2.4 Id1siRNA干擾效率驗證 采用Western印跡法檢測空白組、對照組(空載體組)、抑表達組 Id1蛋白的表達分別為0.450±0.036 9、0.526±0.146、0.192±0.080 0，相對于對照組，Id1抑表達組Id1蛋白表達明顯降低(P＜0.01)，證實Id1抑表達成功。Western印跡結(jié)果見圖4。

2.5 干擾后各組VEGF mRNA和蛋白表達變化 采用RTPCR法檢測空白組、對照組(空載體組)、抑表達組VEGF/GAPDH mRNA分別為:0.006 16±0.000 829、0.006 26±0.000 447、0.002 3±0.000 308。采用Western印跡法檢測空白組、對照組(空載體組)、抑表達組 VEGF/GAPDH蛋白分別為:0.450±0.039 3、0.464±0.023 1、0.231±0.027 3。Western 印跡結(jié)果見圖5所示。Id1抑表達能顯著下調(diào)VEGF mRNA和蛋白表達(P ＜0.01)。

2.6 干擾后各組MTT結(jié)果 培養(yǎng)第1、2天，各組間吸光度(OD值)相比無顯著性差別(P＞0.05);培養(yǎng)至第3天起，抑表達組增殖活性減弱(P＞0.05)，隨著時間的延長，抑表達組細胞從第4天開始出現(xiàn)較為明顯的生長抑制，表現(xiàn)為OD值較對照組明顯降低(P＜0.01)。空載體組與對照組的生長曲線非常接近(P＞0.05)，說明其增殖活性不受影響。見表2，生長曲線見圖6。

圖4 Id1抑表達對Id1蛋白表達的影響

圖5 Id1抑表達對VEGF蛋白表達的影響

表2 Id1抑表達各組MTT法各組OD值(x±s)

圖6 抑表達各組生長曲線

3 討論

結(jié)腸癌發(fā)生不僅是癌細胞不斷增殖的過程，也是細胞分化不斷抑制的過程，結(jié)腸癌細胞的惡性程度與分化程度密切相關(guān)。細胞的分化程度提示腫瘤的良惡性，并直接影響其預(yù)后。Id1是1990年 Benezra等〔5〕從小鼠紅白血病細胞互補 DNA(cDNA)文庫中克隆出來的。它與一些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合成非活性異二聚體后，抑制bHLH與DNA及其他組織特異性bHLH轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，負調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性，從而抑制細胞分化，從而促進細胞增殖〔6〕。目前確定在20多種人類腫瘤(包括大腸癌、鱗癌、子宮頸癌、胰腺癌、前列腺癌等)中均有 Id1過表達，提示Id1在腫瘤的發(fā)生過程中可能起重要作用，可將其作為這些腫瘤的一個新標志物〔7〕。敲除Id1基因的荷瘤小鼠身上發(fā)現(xiàn)腫瘤不能生長和轉(zhuǎn)移，顯示出廣泛壞死和少血管，血管缺乏分枝出芽。在胰腺腫瘤組織中，Id1的表達水平越高，腫瘤中的血管密度指數(shù)也就越高，都提示Idl的表達和腫瘤的血管發(fā)生密切相關(guān)〔8〕。對前列腺腫瘤進行的研究也發(fā)現(xiàn)同類現(xiàn)象〔9〕。在消化系統(tǒng)的腫瘤中，Id1在結(jié)腸癌、胰腺癌中的表達也異常增高，Id1蛋白在結(jié)腸黏膜的正常組織中沒有表達，而在結(jié)腸癌組織中的表達明顯高于正常組織及癌旁組織。這些均提示Id1蛋白在腫瘤新生血管形成中可能起重要作用。在四個已發(fā)現(xiàn)的Id分子中，Id1在腫瘤中的異常表達更為普遍。但Id1蛋白與其他蛋白相互作用機制及調(diào)控Id1基因表達上游因子和Id1蛋白的下游效應(yīng)因子還不清楚。

腫瘤是一種細胞增殖的疾病，其生長方式及轉(zhuǎn)移要依賴于新生血管網(wǎng)的產(chǎn)生。實驗證實，當(dāng)腫瘤體積小于2～3 mm時，腫瘤生長所需營養(yǎng)物質(zhì)均來源于鄰近的血供系統(tǒng)〔10〕。當(dāng)腫瘤體積大于2～3 mm時，鄰近的血供系統(tǒng)就無法滿足腫瘤生長所需的營養(yǎng)，腫瘤細胞誘導(dǎo)其特異性血管網(wǎng)的形成機制便開始發(fā)揮作用。VEGF是目前發(fā)現(xiàn)腫瘤誘導(dǎo)產(chǎn)生血管網(wǎng)的最重要的細胞因子。VEGF廣泛的表達于內(nèi)皮細胞、成纖維細胞及腫瘤細胞等多種細胞。但VEGF的受體則僅存在于血管內(nèi)皮細胞上，故VEGF是一種特異性作用于血管內(nèi)皮細胞的因子。研究證實VEGF是刺激惡性腫瘤血管形成的重要生長因子〔11〕。也有研究報道〔12〕VEGF與一些惡性腫瘤的血行轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系 。本實驗通過正反兩方面檢測了Id1上調(diào)和下調(diào)后VEGF的表達，上調(diào)Id1后VEGF mRNA及蛋白均顯著提高，這種提高出現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄水平上，同時腫瘤細胞增殖明顯加快;下調(diào)Id1后VEGF mRNA及蛋白均顯著降低，也出現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄水平上，而腫瘤細胞增殖明顯減慢。以上結(jié)果證實了Id1通過下游因子VEGF來產(chǎn)生新生血管網(wǎng)，從而影響腫瘤細胞的增殖。

本研究證實了在結(jié)腸癌HT-29細胞中Id1為VEGF的上游因子，其在結(jié)腸癌細胞增殖中發(fā)揮重要作用，Id1有望成為結(jié)腸癌治療的一個新靶點。但Id1通過何種信號途徑來調(diào)VEGF，以及調(diào)控Id1基因表達上游因子有待今后實驗中進一步明確。

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