李寶坤 王艷杰 趙丹玉 馮曉帆

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，遼寧沈陽 110847

隨著基因技術(shù)的快速發(fā)展，生物芯片在遺傳病及蛋白檢測中得到了廣泛的應(yīng)用。20世紀(jì)90年代人們采用分子生物學(xué)的原理對結(jié)核等進(jìn)行了相關(guān)的研究，并將其做為結(jié)核病在細(xì)菌學(xué)上臨床診斷的手段之一，相關(guān)的研究也不斷的深入。當(dāng)前，人們研究中使用的結(jié)核抗原主要有三種，包括：①結(jié)核致病細(xì)菌的細(xì)胞壁蛋白，常用的有38-kDa和16-kDa等蛋白；②結(jié)核細(xì)菌細(xì)胞壁的脂多糖抗原，產(chǎn)用的有LAM和TBGL等蛋白；③結(jié)核細(xì)菌的菌體。

我國現(xiàn)階段的耐多藥性結(jié)核病的臨床發(fā)病率呈逐年增加的事態(tài)，結(jié)核病的早期診斷就顯得尤為重要。為探討利用生物芯片技術(shù)對結(jié)核分支桿菌抗體進(jìn)行快速檢測，該研究以病原體蛋白分子為模型對結(jié)合LAM、38-kDa及16-kDa進(jìn)行檢測和分析。在檢測過程中把抗原點(diǎn)在芯片的膜表面，并將其與患者血清樣本進(jìn)行雜交，以CCD原理對患者樣本進(jìn)行檢測。該研究就2009年1月—2012年12月間收治的2000例結(jié)核患者的血清樣本進(jìn)行了測試，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 患者樣品來源

實(shí)驗(yàn)收集了確診的結(jié)核病患者2000例的血清樣本，并用50例醫(yī)院健康體檢的血清樣本作為對照。對受試著進(jìn)行空腹取血，將抽取的血液以1500轉(zhuǎn)的速度進(jìn)行離心后取上清液，并進(jìn)行相關(guān)的樣本的檢測。

1.2 測試方法

將蛋白與樣本雜交后對樣品進(jìn)行編號處理，在蛋白芯片的盒窗口中加入4滴試劑A將芯片膜濕潤。取100 μL樣本血清，搖勻后加入到芯片窗口中，使樣本血清滲透到蛋白芯片中，先后加入6滴試劑B、10滴試劑C、6滴試劑D。待反應(yīng)完全后，放入儀器中進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)核指標(biāo)檢出率比較

表1為2000例患者的結(jié)核 LAM、16-kDa、38-kDa指標(biāo)的檢出率，從表1中可以看出LAM檢出率為47.2%(944/2000)，16-kDa檢出率為18.2%(364/2000)，38-kDa的檢出率為23.2%(464/2000)，蛋白檢出率順序依此為LAM、38-kDa及16-kDa。其中結(jié)核的陽性率為31.2%(624/2000)。

對于50例健康體檢的對照組患者，LAM指標(biāo)陽性的有5例，16-kDa及38-kDa指標(biāo)均稱陰性。

表1 患者LAM、16-kDa、38-kDa指標(biāo)的檢出率

2.2 患者各年齡段陽性變化

依據(jù)結(jié)核患者的年齡，將其分為1～29歲、30～59歲及60歲以上年齡組。圖1為患者各年齡段陽性的發(fā)生率，從圖1中可以看出60歲以上患者的陽性率最高，其次為1～29歲年齡組。

3 討論

利用生物蛋白芯片對結(jié)核患者的蛋白制備進(jìn)行檢測，需要將幾個(gè)蛋白指標(biāo)進(jìn)行聯(lián)合檢測，如可將LAM、38-KDa及16-KDa等蛋白 聯(lián)合，聯(lián)合檢測有利于結(jié)核病陽性蛋白檢測的準(zhǔn)確率[1-3]。該研究以LAM蛋白及2種重組的結(jié)核分枝桿菌蛋白抗原對患者進(jìn)行檢測，其結(jié)果并不一致，這主要是由于結(jié)核分枝桿菌抗原的特性造成的，分支桿菌的抗原種類多且十分的繁雜，在人體中的表達(dá)也各不一樣，其會(huì)依據(jù)患者免疫及臨床狀況而表現(xiàn)不同。相當(dāng)一部分的分枝桿菌抗原無法表達(dá)，就會(huì)在測試中檢測不到其抗體。有一部分患者抗體的含量較高，有的則是抗體含量較低，還有一些受到免疫抗體、潛伏的結(jié)核以及環(huán)境中的細(xì)菌影響而發(fā)生變異。這就要求我們在檢測結(jié)核時(shí)，需要聯(lián)合幾種抗原的蛋白芯片檢測技術(shù)，這樣可以在確保檢測蛋白特異性的同時(shí)提升檢測的準(zhǔn)確及敏捷。該文中，患者LAM檢出率為47.2%(944/2000)，16-kDa 檢出 率 為 18.2%(364/2000)，38-kDa 的 檢 出 率為23.2%(464/2000)，蛋白檢出率順序依此為LAM、38-kDa及16-kDa。而其中結(jié)核的陽性率為31.2%(624/2000)。這說明對于三種蛋白抗原聯(lián)合檢測技術(shù)對結(jié)核病的臨床診斷有很好的價(jià)值。

在患者各年齡段陽性率的比較中，可以看出陽性發(fā)生率最高的是60歲以上的老年人組，其次為1～29歲組。其結(jié)果表明結(jié)核病的發(fā)生率可能與患者的免疫能力及勞逸狀況有密切的關(guān)系[4-6]。在治療過程中需要對該組患者進(jìn)行適時(shí)的復(fù)查，做到盡早發(fā)現(xiàn)、治療的目的。

研究表明，LAM、38-kDa及16-kDa蛋白抗原跟結(jié)核患者的感染狀況呈線性關(guān)系。所以，利用生物芯片技術(shù)可以對結(jié)核的LAM、38-kDa及16-kDa蛋白抗體進(jìn)行適時(shí)的動(dòng)態(tài)檢測，可用于結(jié)核病的臨床診斷及治療效果評價(jià)體系。

[1]Yon Reyn C F,Vuola J M.New vaccines for the prevention of tuberculosis[J].Clin Infect Dis,2002,35:465-474.

[2]Brandt L,Feino Cunha J,Weinreich Olsen A,et al.Failure of the Mycobacterium bovis BCG vaccine:some species of environmental mycobacteria block multiplication of BCG and induction of protective immunity to tuberculosis[J].Infect Immun,2002,70:672-678.

[3]Brennan M J,Fruth U.Conference Repot:Global Forum on TBVaccine Research and Development.Geneva:World Health or ganization[J].Tuberculosis,2001,81:365-368.

[4]李洪敏，王巍，陳紅兵，等.應(yīng)用PBT-X2型識別儀進(jìn)行結(jié)核蛋白生物芯片檢測[J].醫(yī)療衛(wèi)生裝備,2007,28(8):64-65.

[5]Horwitz M A,Harth G,Dillon B J,et al.Recombinant bacillus Calmette-Guerin(BCG)Vaccines expressing the Mycobacterium tuberculosis 30-KDa major secretory protein lnduce greater protective immunity against tuberculosis than conventional BCG vaccines in a highly susceptible animal model[J].Proc Natl Acad Sci USA,2000,97:13853-13858.

[6]Weinrich Olsen A,Van Pinxteren L A,Meng Okkels L,et al.Protection of mice with a tuberculosis subunit vaccine based on a fusion protein of antigen 85B and ESAT-6[J].Infect Immun,2001,69:2773-2778.