李 力 陸兆豐 沈 凌

河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科 洛陽 471000

神經(jīng)細胞體外培養(yǎng)的方法已趨成熟，但體內(nèi)培養(yǎng)的神經(jīng)細胞在結(jié)構(gòu)和功能上更接近體內(nèi)生長的神經(jīng)細胞。雞胚絨毛尿囊膜層是天然的培養(yǎng)基［1－2］，將孵化13～15d的雞胚背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元種植于正在孵化的雞胚的絨毛尿囊膜層，使神經(jīng)細胞的培養(yǎng)環(huán)境得到進一步改善，從而提高神經(jīng)細胞生長、分化及再聚集并發(fā)育成正常神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)組織的成功率。

1 材料及方法

1．1 種蛋的選擇及消毒 選擇表面清潔、蛋殼均質(zhì)、蛋形規(guī)范、質(zhì)量50～60g、氣室、氣孔均勻受精雞胚；種蛋用溫水清洗、擦干，于1∶1 000新潔爾滅液中浸泡3min后擦干放入消毒蛋托備用；蛋托采用廢棄的經(jīng)消毒的六孔培養(yǎng)板。

1．2 雞胚培養(yǎng) 種蛋置于（37．8±0．5）℃、相對濕度65%～70%環(huán)境的恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育，轉(zhuǎn)蛋2次／d。將孵育13～15d的種蛋作為供體，孵育3～5d的種蛋作為載體。

1．3 雞胚開窗 孵育3～5d時，將雞蛋在超凈臺中先用安爾碘擦拭，再用75%乙醇擦拭消毒。用無菌砂輪在雞胚的氣室極打磨出一個直徑1．5～2．0cm的圓形窗口，用無菌鑷子輕輕揭去蛋殼及附著的部分卵殼膜，暴露卵殼膜的下半部分。用無菌注射器在下半部分卵殼膜與蛋殼交界處（此處的卵殼膜與下面的尿囊膜之間有一小空隙）注射約0．1mL的PBS，使卵殼膜與尿囊膜分離，然后用鑷子從分離處輕輕揭去卵殼膜，暴露雞胚絨毛尿囊膜層。

1．4 雞胚背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的制取［3－4］及培養(yǎng)［5］取孵 化13～15d的雞胚，用75%酒精消毒蛋殼，并從氣室端磨開，無菌取出胚胎，放入4℃PBS液中反復(fù)清洗后，固定于無菌解剖板上，迅速剪開腹部皮膚并清除腹腔內(nèi)臟器，在解剖顯微鏡下切除腹部椎板，暴露椎管內(nèi)的脊髓，并小心將脊髓從椎管內(nèi)提出。背根神經(jīng)節(jié)（DRG）呈串珠樣位于脊髓的兩側(cè)。逐個摘除脊髓兩旁的DRG，并盡量剝除神經(jīng)節(jié)表面的筋膜，放入35mm培養(yǎng)皿中，眼科剪將神經(jīng)節(jié)剪至1mm3大小的碎塊后移入4mL 0．25%胰蛋白酶內(nèi)，37℃消化40min，1 000r／min離心5min，吸除胰酶消化液，加入FBS液終止消化。1 000r／min離心5min，吸除FBS液換入常規(guī)培養(yǎng)基，將其制成單細胞懸液，細胞計數(shù)后，按1×1 000 000／mL用微量加樣器吸取0．1mL的細胞懸液接種于雞胚絨毛尿囊膜層，然后用無菌的透明膠帶將窗口覆蓋。再將雞胚放入恒溫箱中繼續(xù)孵育。每天通過透明膠帶可直接觀察雞胚的存活情況及移植細胞的情況并定期行病理檢查。

2 結(jié)果

病理檢查顯示，在載體的雞胚絨毛尿囊膜層培養(yǎng)3～5d時，可觀察到神經(jīng)細胞存活（如圖1）。在載體的雞胚絨毛尿囊膜層培養(yǎng)6～9d時，可觀察到神經(jīng)細胞生長（如圖2）。在載體的雞胚絨毛尿囊膜層培養(yǎng)11～13d時，可觀察到神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)形成（圖3、圖4）。

3 討論

體內(nèi)培養(yǎng)的神經(jīng)細胞在結(jié)構(gòu)和功能上更接近體內(nèi)生長的神經(jīng)細胞。雞胚絨毛尿囊膜（chick chorioallantoic membrane，CAM）法簡單、方便、價格便宜、觀察指標明確，是目前國內(nèi)外較常用組織細胞培養(yǎng)模型，雞胚孵化至第8天時，胚膜和血管網(wǎng)的發(fā)育已趨穩(wěn)定，而機體免疫系統(tǒng)尚未完全建立，此時對各種異物幾乎不產(chǎn)生排斥反應(yīng)。受精雞胚是一種干細胞，只有在適宜的外界環(huán)境中（如溫度、濕度、氧飽和度等），才能發(fā)育成個體，而雞胚外液即雞胚絨毛尿囊膜層（雞蛋清）是一種合適的天然“培養(yǎng)基”，具有以下優(yōu)點［2－4］：（1）指標易于觀察；（2）移植物成活率高；（3）取材簡單，接種簡單，條件要求低；（4）移植物生長快，實驗周期短；（5）價格低，經(jīng)濟實用，可同時進行大樣本實驗觀察。作者將摘取的雞胚背根神經(jīng)節(jié)制成單細胞懸液種植于正在孵化的雞胚絨毛尿囊膜層培養(yǎng)，使神經(jīng)細胞的培養(yǎng)環(huán)境得到進一步改善，從圖1～4可以看將雞胚背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元移植于絨毛尿囊膜層培養(yǎng)，DRGn能在雞胚絨毛尿囊膜層生長、分化及再聚集并發(fā)育成正常神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)組織。為背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的研究和腦、脊髓等神經(jīng)組織損傷后的修復(fù)、功能恢復(fù)和基層醫(yī)院及醫(yī)學(xué)教學(xué)提供一種易于觀察、取材方便、價格低、實驗周期短、經(jīng)濟實用的干細胞內(nèi)培養(yǎng)方法［6－7］。

圖1 神經(jīng)細胞存活

圖2 神經(jīng)細胞生長

圖3 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)形成

圖4 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)形成

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