戴園園 沈棟林 李 蕊 孫明霞

徐州醫(yī)學院附屬醫(yī)院兒科 徐州 221000

1 材料與方法

1．1 臨床資料

1．1．2 對照組：對照組來自于同期上呼吸道感染住院患兒，年齡6個月～12歲，平均（4．5±3．8）歲，既往無抽搐史，無慢性病史，無長期服用任何藥物史。以上3組兒童年齡、性別差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05），留取血液標本征得家長同意。

1．2 方法

1．2．1 半定量RT－PCR檢測：抽取外周靜脈2mL，用淋巴細胞分離液分離單個核細胞，Trizol試劑提取細胞RNA。引物設計：β－actin為內(nèi)參標準，依據(jù)GenBankBC002409應用DNAStar軟件設計為擴增片段長度526bp：上游5’－CTTAGTTGCGTTACACCCTTTC－3’，下 游：5’－GT－CACCTTCACCGTTCCAGT－3’；MDR1引物擴增片段長度165 bp：上游5’－AGCCCATCCTGTTTGACTGC－3’，下游5’－TGATGCGTGC2CATGCTCCTT－3’；RT－PCR采用 Tukala試劑盒 （大連寶生物公司）、PE9600基因擴增儀 （美國PERKINELMER公司）。反應體系包含5×Buffer 4μL，10 mmol／L dNTPs混合液1μL，上、下游引物各1μL，混合酶1 μL，溶解液3μL，上述反轉錄生成的cDNA 1μL，無RNase ddH2O 8μL，共20μL。置于PCR儀中，37℃15min逆轉錄，95℃15min激活進入PCR循環(huán)：94℃預變性3min，94℃變性30s，57．5℃退火30s，72℃延伸1min，內(nèi)參進行33個循環(huán)。取RT－PCR產(chǎn)物12μL，1μL 6×溴酚蘭，TAE應用TAE電泳緩沖液，2%瓊脂糖凝膠電泳，電壓100μV、40 mA，45min后紫外成像系統(tǒng) （Vilber凝膠成像分析系統(tǒng)，法國Lourmat公司）觀察電泳結果并照相。以特定擴增產(chǎn)物條帶灰度值與β－actin擴增產(chǎn)物條帶灰度值之比代表MDR1的表達水平。

1．3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 16．0軟件進行處理，正態(tài)分布數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，數(shù)據(jù)經(jīng)方差齊性檢驗，用完全隨機設計的單因素方差分析進行各組間比較，用SLD－t檢驗方法進行兩兩比較。P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

OXC組外周血 MDR1－mRNA表達在用藥后6個月和12個月較服藥前均有增高（F＝6．32，P＜0．05）；OXC組和CBZ組2組患兒外周血MDR1－mRNA表達在用藥后6個月和12個月較服藥前亦有增高（F＝5．43，P＜0．05）；用藥后6個月及12個月，OXC組外周血 MDR1－mRNA相對表達量和CBZ組比較差異無統(tǒng)計學意義（F＝2．68，P＞0．05）。見圖1、表1。1、2、3、4分別為OXC組治療后12個月、OXC組治療后6個月、OXC組治療前和對照組；5、6、7、8分別為CBZ組治療后12個月、CBZ組治療后6個月、CBZ組治療前和對照組。

圖1 MDR1／β－actin的 RT－PCR電泳結果

表1 3組患兒不同時間點外周血MDR1／β－actin比值

3 討論

有體外實驗顯示［8］，OXC、CBZ及其活性代謝產(chǎn)物均是Pgp的底物；Clinckers等［9］應用微量透析法研究顯示OXC可以增加癲大鼠血腦屏障Pgp含量，而加用耐藥蛋白抑制劑丙磺舒或維拉帕米后OXC的抗驚厥療效顯著增強；Marchi等［10］應用RT－PCR法觀察OXC耐藥癲患者切除腦組織發(fā)現(xiàn) MDR1－mRNA表達增高，推測難治性癲腦內(nèi)MDR1和Pgp的表達增高和藥物之間有一定關聯(lián)。本研究中選擇了OXC單藥治療的癲患兒，經(jīng)過1a的觀察，結果顯示，口服OXC半年后，患兒外周血中 MDR1－mRNA表達量即開始增加，1a后MDR1－mRNA表達量較半年時增加，顯示長期口服OXC可以增加癲患兒MDR1的表達，并且和時間相關，長期應用后可被Pgp識別從而限制其通過血腦屏障，降低藥物在腦中的濃度，影響藥物療效。實驗采用的是測外周血MDR1－mRNA相對表達量的方法，取材簡易方便，有利于動態(tài)觀察，癲發(fā)作后，血腦屏障受損，腦內(nèi)MDR1基因mRNA及其表達產(chǎn)物Pgp可進入外周血內(nèi)，因此，外周血MDR1基因mRNA可在一定程度上反映其在腦內(nèi)的表達。

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