王麗秀

(白鷺醫(yī)藥技術(shù)(上海)有限公司 上海 201203)

Caco-2細(xì)胞來源于人體結(jié)腸癌上皮細(xì)(Humancocloncarcinomacellline:Caco-2),在滲透聚碳酸醋膜上培養(yǎng)分化成為融合的單層上皮細(xì)胞,因其功能表達(dá)及通透性能與小腸類似,最近今年,Caco-2已被國內(nèi)科研人員廣泛應(yīng)用于藥物在小腸吸收的實驗及研究之中,通過測試藥物與體內(nèi)吸收間的相互作用,深入了解藥物的吸收原理,同時分析藥物在其小腸中代謝的情況,這些實驗結(jié)果給新藥的研發(fā)帶來了極大的促進作用。然而Caco-2細(xì)胞其自身及培養(yǎng)體系存在相應(yīng)局限性,如:小腸上皮細(xì)胞與Caco-2細(xì)胞中轉(zhuǎn)運蛋白、核受體和代謝酶存在著一定差異,沒有腸道用于吸收的主要屏障勃液層;培養(yǎng)Caco-2細(xì)胞的周期較長、培養(yǎng)體系對藥物的吸收在一定程度上也對其有影響。綜上所述的種種不足使Caco-2細(xì)胞未能作為一個理想的模擬人體小腸上皮細(xì)胞的模型,限制了該細(xì)胞在部分口服藥物中的廣泛運用。為能夠讓體內(nèi)小腸的生理境況更好的進行模擬,使藥物的代謝情況和轉(zhuǎn)運在腸道內(nèi)可以更加準(zhǔn)確的被預(yù)測,工作者針對Caco-2細(xì)胞的以上不足之處展開了詳細(xì)的規(guī)劃與策略,對其進行全面的改良工作,其中包括對細(xì)胞內(nèi)代謝酶和轉(zhuǎn)運蛋白表達(dá)的改善,增加薪液層,將培養(yǎng)周期縮短,將藥物溶解性增加等一系列方法。本文系統(tǒng)的對Caco-2的改良工作進行綜述,以便于同領(lǐng)域中的其他研究工作者能在實際研究中更加科學(xué)、精確、有效的利用該細(xì)胞模型。

1 簡介Caco-2細(xì)胞的單層模型

與小腸上皮細(xì)胞相比,Caco-2細(xì)胞中CYP酶和P糖蛋白的表達(dá)相對不高,而核受體可以同等地調(diào)節(jié)很多代謝基因的表達(dá),在傳統(tǒng)的且一般的培養(yǎng)環(huán)境下,Caco-2細(xì)胞能夠自發(fā)地分化為腸上皮細(xì)胞單層在多聚碳酸酯膜上,而且能穩(wěn)定存在于小腸上皮的細(xì)胞、各種轉(zhuǎn)運系統(tǒng)、代謝酶等,多種主動轉(zhuǎn)運系統(tǒng)在Caco-2細(xì)胞中都有與小腸上皮細(xì)胞類似的表達(dá),如谷氨酰胺轉(zhuǎn)肽酶、葡萄糖醛酸酶細(xì)胞色素同工酶及糖、氨基酸、二肽、維生素B12、堿性磷酸酶、蔗糖酶等。

2 化學(xué)物質(zhì)的誘導(dǎo)及藥物的吸收機制

(1)Caco-2細(xì)胞能夠表達(dá)多種的轉(zhuǎn)運體,同時大多數(shù)藥物也經(jīng)過多種轉(zhuǎn)運體轉(zhuǎn)運,當(dāng)缺少該轉(zhuǎn)運體、且特異性抑制藥、研究藥物轉(zhuǎn)運體與Caco-2細(xì)胞相互作用時,想要獲得精確可靠的結(jié)果就相當(dāng)困難。在這樣的情況下,可以通過一些方法來改變特定轉(zhuǎn)運體的表達(dá),如基因敲除法,亦可應(yīng)用化學(xué)誘導(dǎo)方式進行。在誘導(dǎo)CYP3A4的表達(dá)上,維生素D發(fā)揮的效果十分明顯。CYP2B6和CYP2C9在一定程度上也起到不錯的誘導(dǎo)作用,在模擬藥物在小腸的吸收和代謝乏研究中,該誘導(dǎo)模型以其顯著的性能被公認(rèn)為一種標(biāo)準(zhǔn)模型,其誘導(dǎo)效果也非常顯著。

(2)針對藥物吸收機制的研究。藥物通過腸上皮細(xì)胞有以下四種可能的轉(zhuǎn)運方式:細(xì)胞旁路轉(zhuǎn)運、被動轉(zhuǎn)運、載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)運和胞飲。相關(guān)人員對隱丹參酮的吸收機制進行系統(tǒng)的研究,結(jié)果表明,隱丹參酮的吸收方式主要是由載體介導(dǎo)的主動轉(zhuǎn)運,且該主動轉(zhuǎn)運的載體位于Caco-2細(xì)胞單層的頂端。研究者還系統(tǒng)的對丹參素在Caco-2細(xì)胞模型中的跨膜轉(zhuǎn)運機制進行了相關(guān)研究,結(jié)果表明丹參素在Caco-2細(xì)胞模型中的轉(zhuǎn)運可能主要是由轉(zhuǎn)運蛋白P-gp(P-糖蛋白)介導(dǎo)的主動轉(zhuǎn)運。隨著計算機輔助設(shè)計、組合化學(xué)和方法在藥物合成中廣泛應(yīng)用的今天,候選藥物的化合物指數(shù)呈正趨勢向上增長,最初被淘汰的化合物有50%～60%是由于較差的小腸吸收和代謝。對小腸粘膜通透性差的藥物,Caco-2 細(xì)胞能很好的將其排除。Laitinen等對維拉帕米、普萘洛爾等藥物采用Caco-2細(xì)胞實驗,在提高篩選藥物的速度上起到很到作用,結(jié)果表明,聯(lián)合用藥可以使生物的利用程度得到提高。

(3)在藥物代謝研究中怎樣對Caco-2細(xì)胞進行應(yīng)用。Caco-2細(xì)胞模型在研究藥物吸收機制、預(yù)測體內(nèi)吸收和藥物相互作用上、新藥設(shè)計和評價藥物安全性上都是良好的工具,與整體吸收具有很好的相關(guān)性。在Caco-2細(xì)胞上,存在許多小腸刷狀膜上皮相關(guān)的酶系,這些相關(guān)酶系可以用來研究藥物分子經(jīng)小腸上皮的首過代謝。在化合物的吸收上有一種物質(zhì)非常復(fù)雜,那就是黃酮類。黃酮類的吸收程度不僅取決于分子的脂溶性,還取決于其是否糖基化。結(jié)果表明Caco-2細(xì)胞也可用來研究藥物對代謝酶的影響。但毋庸置疑,Caco-2細(xì)胞單層模型同樣存在一些缺點:一是Caco-2因其由單一細(xì)胞構(gòu)成,缺少細(xì)胞異質(zhì)性;二是細(xì)胞缺乏杯狀細(xì)胞用來分泌粘液,缺乏小腸上皮中的粘液層;三是與正常小腸相比,EER值效高,無形中限制了水溶性小分子藥物穿細(xì)胞間轉(zhuǎn)運的應(yīng)用研究;四是Caco-2細(xì)胞的吸收轉(zhuǎn)運體表達(dá)較小腸上皮的低,在主動轉(zhuǎn)運藥物的研究方面,其不如被動擴散藥物研究的成功;第五是由于不同實驗室的培養(yǎng)條件存在一定差異,結(jié)果有時缺乏可比性。但隨著TC27細(xì)胞模型、加速的Caco-2細(xì)胞穿透模型的出現(xiàn),原有Caco-2細(xì)胞單層模型的種種缺點和不足將逐個被克服,相關(guān)研究人員目前已運用基因重組與化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)等多方手段對其展開了系統(tǒng)的、完善的改良工作,且在改善Caco-2 培養(yǎng)條件、在Caco-2細(xì)胞模型發(fā)展的自動化和微型化上,使Caco-2細(xì)胞模型在藥物開發(fā)研究中將發(fā)揮前所未有的作用,且研發(fā)進展呈穩(wěn)定的直線上升。

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