王忠雷 楊麗燕 曾祥偉 李朋收 張小華

(1北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京，100102;2中國(guó)石油大學(xué)(北京)理學(xué)院;3北京豐泰金源藥業(yè)有限公司)

隨著中藥研究與開(kāi)發(fā)現(xiàn)代化的進(jìn)程，經(jīng)典的提取方法如溶劑提取法、水蒸氣蒸餾法、壓榨法及升華法等因有效成分提取率不高、雜質(zhì)清除率低等弊端，已經(jīng)難以滿足社會(huì)發(fā)展的需求。而一些新型、高效的提取新技術(shù)、新方法，已在近年的中藥研究中陸續(xù)顯現(xiàn)出各自的優(yōu)勢(shì)。筆者僅以酶反應(yīng)提取技術(shù)為例，論述其在中藥化學(xué)成分提取中的應(yīng)用進(jìn)展及方法特點(diǎn)，以期中藥提取新技術(shù)能夠更加合理有效地應(yīng)用于中藥研發(fā)過(guò)程［1］。

1 酶的古代應(yīng)用及酶提取技術(shù)的形成

一方面，人類在生產(chǎn)活動(dòng)中有目的地利用生物酶已有幾千年歷史，例如釀酒、制作飴糖、制醬等。從龍山文化遺存的大量陶制貯酒可以推知，遠(yuǎn)在5000年前，我們祖先已開(kāi)始人工釀酒了;早在3000多年前國(guó)人已應(yīng)用微生物發(fā)酵方法進(jìn)行麻纖維的漚漬脫膠;另外，在1000多年前的《齊民要術(shù)》中已有用“魚(yú)醬汁”來(lái)調(diào)味的論述。但由于歷史原因和科技的限制，當(dāng)時(shí)的人們沒(méi)有意識(shí)到、也不可能意識(shí)到這是“酶”在起作用［2］。

另一方面，酶反應(yīng)提取技術(shù)真正形成則源于近代。酶化學(xué)是從1814年，Kirchhoff發(fā)現(xiàn)淀粉酶以后開(kāi)始的。1926年，Sumner首次得到尿酶結(jié)晶以及Northorp對(duì)蛋白水解酶的研究，逐步建立酶化學(xué)的基礎(chǔ)。20世紀(jì)50年代中期，多學(xué)科的互相滲透使酶化學(xué)迅速發(fā)展。人們通過(guò)對(duì)氨基酸排列結(jié)構(gòu)，酶的生物催化活性本質(zhì)以及酶的專一性等的研究，使生物酶的應(yīng)用逐步發(fā)展成為制藥工業(yè)的重要手段之一。然而酶法在中藥提取中的應(yīng)用到20世紀(jì)90年代才陸續(xù)見(jiàn)報(bào)。21世紀(jì)以來(lái)，酶反應(yīng)提取技術(shù)在中藥化學(xué)成分提取中的應(yīng)用日益普遍，并取得了較好的效果［3］。

2 酶反應(yīng)提取技術(shù)的原理及特點(diǎn)

植物類藥材約占中藥總量的90%，其活性成分主要存在于植物細(xì)胞壁內(nèi)。因此，細(xì)胞壁的多糖類物質(zhì)所構(gòu)成的致密結(jié)構(gòu)自然成為了中藥有效成分提取的主要屏障。而酶反應(yīng)提取技術(shù)，即向待提取的中藥液中加入某些特定的酶，通過(guò)破壞構(gòu)成細(xì)胞壁的纖維素的基本單元的β－葡萄糖苷鍵等，導(dǎo)致細(xì)胞壁等處的纖維素、果膠等物質(zhì)降解，從而使其致密性降低，以減少細(xì)胞原生質(zhì)中的有效成分向溶媒擴(kuò)散時(shí)細(xì)胞壁及細(xì)胞間質(zhì)的阻力，進(jìn)而有利于有效成分的提取。以上內(nèi)容即為酶反應(yīng)提取技術(shù)的基本原理。

酶反應(yīng)提取技術(shù)在中藥有效成分提取中得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用源于其如下特點(diǎn):在較溫和的條件下提取，提取產(chǎn)物活性較高，穩(wěn)定性較好。但是，酶反應(yīng)提取技術(shù)同時(shí)受到最佳反應(yīng)溫度、pH值、酶及底物濃度、抑制劑和激動(dòng)劑對(duì)提取物的影響等條件的制約［4］。

3 酶提取技術(shù)在中藥中的應(yīng)用

中藥品種繁多，有效成分的類型差異較大，因此需要按實(shí)際情況選擇不同種類的酶來(lái)提取。常用的酶反應(yīng)提取方法有復(fù)合酶法、纖維素酶法、果膠酶、超聲酶法及轉(zhuǎn)苷酶法等。

3.1 纖維素酶法 植物細(xì)胞壁主要成分是纖維素，干燥植物體中纖維素占1/3～1/2，是形成植物細(xì)胞壁的框架。纖維素是β－葡萄糖以β－1，4－糖苷鍵連成的直鏈分子，而纖維素酶可降解β－1，4－糖苷鍵從而破壞植物細(xì)胞壁［5］。韓偉等［6］采用纖維素酶、果膠酶、蛋白酶等酶法提取積雪草中的積雪草苷，結(jié)合正交試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在纖維素酶與底物積雪草質(zhì)量比m(E)∶m(S)=1∶50的時(shí)候，具有較理想的提取率。與傳統(tǒng)提取方法相比，酶法提取速率快，工藝條件溫和，得率高，是一種良好的提取方法。馬桔云等［7］在從中藥飲片中提取穿心蓮內(nèi)酯之前，先對(duì)原藥材飲片進(jìn)行纖維素酶解處理以破壞β－葡萄糖苷鍵，其他條件與原工藝相同，結(jié)果發(fā)現(xiàn)穿心蓮內(nèi)酯的含量和提取量均較原提取工藝高，且對(duì)所提取有效成分沒(méi)有影響，并考慮將它用于穿心蓮提取的工業(yè)化生產(chǎn)中。李永生等［8］通過(guò)比較纖維素酶、半仿生、乙醇回流提取方法對(duì)川烏中烏頭堿、烏頭總堿的影響，篩選最佳方法，利用纖維素酶輔助提取川烏生物堿，以烏頭堿、烏頭總堿提取率為指標(biāo)，正交試驗(yàn)優(yōu)化纖維素酶的最佳提取條件，再與半仿生、乙醇提取方法進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)證明，酶用量8mg/g時(shí)烏頭堿提取率高達(dá)0.002 447%，烏頭總堿提取率高達(dá)0.244 410%，而半仿生提取烏頭堿、烏頭總堿的提取率分別為0.001 735%、0.189 340%，乙醇回流提取烏頭堿、烏頭總堿提取率分別為0.001 869%、0.200 720%，可知纖維素酶提取法具有明顯的優(yōu)勢(shì)。張華芳［9］等研究表明，用纖維素酶法提取羊棲菜多糖，以褐藻膠得率和羊棲菜粗多糖為定量指標(biāo)，采用正交設(shè)計(jì)優(yōu)選酶法提取條件，所得的多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.89%，較水提醇沉法、堿提醇沉法等有顯著提高。

3.2 果膠酶 果膠酶由黑曲霉發(fā)酵所得，是分解果膠復(fù)合物的酶的總稱，可分為果膠甲酯酶和多聚半乳糖醛酸酶。藍(lán)峻峰等［10］通過(guò)添加果膠酶提取葉下珠有效成分，以沒(méi)食子酸提取率為考察指標(biāo)，用高效液相色譜法測(cè)其含量，利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選其提取工藝，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在果膠酶濃度為1.5g/L時(shí)，葉下珠沒(méi)食子酸的平均提取率高達(dá)1.053%。因該工藝條件在較低的溫度下、較短的時(shí)間內(nèi)可較大程度提高葉下珠有效成分提取效率，故而有效地降低了提取能耗，而且提取過(guò)程中不使用有機(jī)溶劑，對(duì)環(huán)境友好，易于實(shí)現(xiàn)綠色工業(yè)化生產(chǎn)。李玲等［11］研究采用果膠酶提取川芎多糖的最佳工藝條件，方法為采用單因素實(shí)驗(yàn)和正交設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)選，考察酶用量、pH、反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度對(duì)川芎多糖提取的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在果膠酶用量為1%條件下，川芎多糖的平均得率高達(dá)11.3%。

3.3 復(fù)合酶法 復(fù)合酶法因其操作簡(jiǎn)單、高效、穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)近幾年已被廣泛應(yīng)用在中藥活性成分的提取中。劉穎新等［12］以毛脈酸模的根為原料，采用復(fù)合酶提取，通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)選條件，實(shí)驗(yàn)表明，在所用酶量為3%時(shí)對(duì)其有效成分有較理想的提取。王穎莉等［13］研究酶法結(jié)合傳統(tǒng)回流法提取遠(yuǎn)志總皂普工藝條件，利用可見(jiàn)分光光度法測(cè)定遠(yuǎn)志總皂苷含量，考察植物復(fù)合酶的酶解時(shí)間、酶解溫度對(duì)傳統(tǒng)提取工藝的強(qiáng)化效果，通過(guò)顯微結(jié)構(gòu)圖和紅外光譜圖說(shuō)明了復(fù)合酶法強(qiáng)化傳統(tǒng)提取法的作用方式及提取物的結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明酶用量為0.4%時(shí)，可提高遠(yuǎn)志總皂普提取率、縮短提取時(shí)間、減少乙醇使用量，這對(duì)于遠(yuǎn)志流浸膏的高效提取具有一定指導(dǎo)意義。另外，劉國(guó)際等［14］以復(fù)合酶法提取薯蕷皂苷元，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，復(fù)合酶法較其他酶法具有一定優(yōu)勢(shì)。且本實(shí)驗(yàn)所選用的酶為粗制品，價(jià)格廉價(jià)，有助于薯蕷皂苷元大規(guī)?；a(chǎn)。張明春等［15］以水提工藝為對(duì)照，研究了纖維素酶與果膠酶復(fù)合酶法提取酸棗仁黃酮新工藝。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在纖維素酶與果膠酶比為1∶1.30U/g酸棗仁時(shí)提取。該工藝的酸棗仁黃酮提取率比傳統(tǒng)水提工藝提高了54.67%。張明［16］以山東大青葉為材料，以復(fù)合酶水解、乙醇沉淀法提取其中的多糖。通過(guò)正交試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在纖維素酶1.5%、果膠酶2.0%、胰蛋白酶1.5%的條件下大青葉多糖的平均得率可高達(dá)18.24%。

3.4 轉(zhuǎn)苷酶法 轉(zhuǎn)苷酶是葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶的簡(jiǎn)稱，轉(zhuǎn)苷酶法在中藥提取與啤酒發(fā)酵等已有應(yīng)用并顯示了明顯的優(yōu)勢(shì)。許明淑等［17］以銀杏葉為原料，利用 Suhong475轉(zhuǎn)苷酶將黃酮苷元轉(zhuǎn)為黃酮苷以提高其水溶性，再以低濃度的乙醇溶液提取，結(jié)果表明，總黃酮的提取率比未加酶的對(duì)照組增加了44%。其實(shí)，早在上世紀(jì)90年代，日本學(xué)者高根芳春就已采用轉(zhuǎn)苷酶對(duì)黃酮苷元進(jìn)行提取，通過(guò)糖基轉(zhuǎn)移獲得了更高活性、更便于人體吸收利用的銀杏葉的有效成分槲皮素苷，使其黃酮提取率從原先的0.22%提升為0.38%。另外，轉(zhuǎn)苷酶法還有更廣泛的應(yīng)用，如李峰等［18］用跳躍式糖化與加轉(zhuǎn)苷酶相結(jié)合的方法，生產(chǎn)出了更加優(yōu)質(zhì)的低醇啤酒。

3.5 超聲―酶法 賁永光等［19］以黃芪飲片為原料，結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)，采用超聲―酶法提取黃芪總多糖，并通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化其提取工藝。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在超聲提取時(shí)間30min、酶量10mg等條件下，黃芪多糖的提取率為24.2%，較傳統(tǒng)水提工藝有明顯提高。陶濤等［20］以九華山黃精為原料，水為提取溶劑，采用超聲波協(xié)同纖維素酶方法對(duì)其多糖和皂苷進(jìn)行綜合提取。通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在纖維素酶與底物質(zhì)量比為1%時(shí)，多糖和皂苷提取率分別是39.36%和11.69%。相比傳統(tǒng)提取方法，多糖和皂苷的提取率均有了提高。另外，徐艷等［21］研究超聲―酶法在黃柏的小檗堿提取中的應(yīng)用效果，同樣采用單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在超聲功率為80%、加酶25mL時(shí)黃柏小檗堿的提取率高，且具有高效、節(jié)能等優(yōu)勢(shì)。周琳等［22］研究報(bào)道了超聲―酶法提取三七總皂苷，以三七提取液中總皂苷的含量和提取物得率為指標(biāo)，并采用四因素、三水平正交設(shè)計(jì)法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在纖維素酶與果膠酶用量比為3∶28時(shí)，三七提取液中總皂苷得率高達(dá)35.17%。

4 結(jié)語(yǔ)

隨著現(xiàn)代科學(xué)的迅猛發(fā)展與中藥現(xiàn)代化步伐的加快，酶反應(yīng)提取技術(shù)因其高效節(jié)能、方法簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)而在中藥提取中的應(yīng)用日益頻繁。雖然目前該方法在實(shí)驗(yàn)條件及酶種類等方面存在一定的局限性，但隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，相信該方法將在中藥的提取方面展示更加廣泛的應(yīng)用前景。

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