文德學，顧雪梅，王興林，胡忠惠，蘭興翠，李 瑩（.貴州省黔西南州人民醫(yī)院，貴州興義 56400；.貴州省興義市人民醫(yī)院，貴州興義 56400）

實驗室質控工作需要保存各種質控菌株，保證質控菌株的穩(wěn)定是做好質控工作的前提條件。保存菌種方法很多，根據(jù)不同的微生物菌株或不同的實驗要求，可選用不同的保存方[1]。常見的有傳代培養(yǎng)保存法、液體石蠟覆蓋保存法、冷凍保存法、冷凍干燥保存法等[2－3]。銅綠假單胞菌、大腸埃希菌等許多非苛養(yǎng)菌質控菌株都是生長條件要求不高的細菌，通常用斜面瓊脂培養(yǎng)基和半固體瓊脂培養(yǎng)基覆蓋石蠟油等方法均可很好保存，但是需要頻繁移種以保證存活率，而反復傳代又易導致細菌變異并造成菌種污染。一些常用的苛養(yǎng)質控菌株如肺炎鏈球菌、腦膜炎奈瑟菌、流感嗜血桿菌等在斜面瓊脂培養(yǎng)基和半固體瓊脂培養(yǎng)基上不能存活，沒有條件的基層實驗室難以保存這些苛養(yǎng)菌。在保存過程中必須使微生物的代謝處于相對靜止狀態(tài)，才能在一定時間內使其不發(fā)生變異又保持很好的活性。作者借鑒應用菌種濾紙保存法，基本滿足上述3個條件，實驗證明是一種經(jīng)濟有效、簡便的菌種保存方法，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 自封袋：根據(jù)需要購買適宜大小的自封袋，也可使用試劑附送的自封袋。無菌EP管：將市售2cm直徑EP管置于密閉的消毒盒內，經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌25min備用。無菌濾紙條：將市售濾紙用剪刀剪成約0.5cm×1.0cm濾紙條置于帶塞的小試管內，經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌25min備用。菌種：銅綠假單胞菌（ATCC 27853）、大腸埃希菌（ATCC 25922）、金黃色葡萄球菌（ATCC 25923）3株標準菌株購于衛(wèi)生部臨床檢驗中心，福氏志賀菌、枯草芽孢桿菌、奇異變形桿菌、普通變形桿菌、陰溝腸桿菌、產氣腸桿菌、豚鼠氣單胞菌、糞腸球菌、弗勞地枸櫞酸桿菌、傷寒沙門菌、痢疾志賀菌、宋內志賀菌、鮑曼不動桿菌、黏質沙雷菌、嗜麥芽窄食單胞菌、甲型副傷寒桿菌、摩根菌、白色假絲酵母菌、克柔假絲酵母菌、熱帶念珠菌、光滑念珠菌、季也蒙念珠菌、肺炎鏈球菌、淋球菌、腦膜炎奈瑟菌、流感嗜血桿菌、無乳鏈球菌、屎腸球菌、卡他莫拉菌、產單核李斯特菌、星座鏈球菌等31株菌株來自于臨床標本分離的菌株，經(jīng)傳代分純培養(yǎng)而得。

1.2 儀器與試劑 血平皿及巧克力平皿：成品購于安圖公司，在適宜的貯存條件下、有效期內使用；沙保羅斜面培養(yǎng)基：半成品購于杭州天合微生物試劑有限公司，按照說明書配制經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌25min后擺成斜面?zhèn)溆?；觸酶試劑：市售3%過氧化氫溶液，有效期內使用，試驗時金黃色葡萄球菌同步作陽性對照；膽汁溶菌實驗試劑：取新鮮牛膽汁，無菌分裝（2毫升/管）密封置－20℃冰箱，可保存1年以上，試驗時用肺炎鏈球菌平行做陽性對照；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：半成品購于杭州天合微生物試劑有限公司。按照說明書配制成成品肉湯后，分裝于有塞小試管，每管1mL，經(jīng)121℃25min高壓蒸汽滅菌后備用；－20℃冰箱：購于海爾公司的－20℃低溫冰箱；細菌鑒定及藥敏試驗儀器：購于美國BD公司的Phoein100全自動細菌鑒定儀。

1.3 方法

1.3.1 菌種保存 將目標菌種在血平皿或巧克力平皿上劃線分離培養(yǎng)18～24h，獲取純凈菌落，然后用無菌眼科鑷夾取1張無菌0.5cm×1.0cm濾紙條，根據(jù)菌落大小，蘸取一到數(shù)個菌落（以粘菌面積不超過濾紙1/3，濾紙條尚未完全被水分浸濕為宜），放入無菌EP管中，蓋緊EP管蓋。根據(jù)需要，一次可制備數(shù)十條，1～2條裝1個EP管，貼上標簽，標簽上注明菌種名稱，保存數(shù)量和保存日期，再置于自封袋內，排盡袋內空氣，封嚴袋口，放入－20℃冰箱保存。

1.3.2 菌種的生物性狀觀察和檢測 將上述方法保存的菌種于1個月、3個月、6個月、1年、2年對應時間取出上述各種菌株的一只菌種管直接置于室溫環(huán)境平衡5～10min，無菌操作取出相應菌種濾紙條，放入無菌營養(yǎng)肉湯管中復溶，轉種在血平皿或巧克力平皿上35℃培養(yǎng)18～24h，觀察所保存的31株菌株的存活情況、菌落形態(tài)特征等有無變化；并對其中2株標準菌株：銅綠假單胞菌（ATCC 27853）和大腸埃希菌（ATCC 25922）在保存1年和2年時復溶轉種血平皿35℃培養(yǎng)18～24 h后，用Phoein100全自動細菌鑒定儀2次進行生化鑒定和藥敏試驗進行比較。

2 結 果

2.1 2009年5月保存17株菌株，分別是福氏志賀菌、枯草芽孢桿菌、奇異變形桿菌、普通變形桿菌、陰溝腸桿菌、產氣腸桿菌、豚鼠氣單胞菌、糞腸球菌、弗勞地枸櫞酸桿菌、傷寒沙門菌、甲型副傷寒桿菌、卡他莫拉菌、摩根菌、產單核李斯特菌、無乳鏈球菌、屎腸球菌、星座鏈球菌；2009年7月保存5株菌株，分別是痢疾志賀菌、宋內志賀菌、鮑曼不動桿菌、黏質沙雷菌、嗜麥芽窄食單胞菌；2009年10月保存5株酵母樣真菌，分別是白色假絲酵母菌、克柔假絲酵母菌、熱帶念珠菌、季也蒙念珠菌、光滑念珠菌。一共22株非苛養(yǎng)菌及5株酵母樣真菌，在保存到上述1個月、3個月、6個月、1年、2年5個時間段時用營養(yǎng)肉湯復蘇分別移種到血平皿和沙保羅瓊脂斜面培養(yǎng)基上，經(jīng)35℃培養(yǎng)18～24h，22株菌存活率均為100%，菌落形態(tài)特征無明顯改變且生長良好。

2.2 2009年7月保存2株菌株，分別是肺炎鏈球菌和淋球菌。肺炎鏈球菌在上述1個月、3個月、6個月、1年、2年5個時間段用營養(yǎng)肉湯復蘇移種血平皿經(jīng)35℃、5%二氧化碳（CO2）環(huán)境培養(yǎng)18～24h均100%存活，菌落形態(tài)特征無明顯改，觸酶試驗、膽汁溶菌試驗均為陽性。在保存2年時生長稍欠佳，僅生長量減少，其他特征無明顯改變。淋球菌在保存1個月后經(jīng)2次用營養(yǎng)肉湯復蘇移種于血平皿及巧克力平皿經(jīng)35℃、5%CO2環(huán)境培養(yǎng)18～24h均不生長，證明已死亡。

2.3 2011年3月保存2株菌株，分別是腦膜炎奈瑟菌和流感嗜血桿菌。到2011年9月經(jīng)1、3、6個月3個時間段用營養(yǎng)肉湯復蘇移種巧克力平皿上經(jīng)35℃、5%CO2環(huán)境培養(yǎng)18～24h均100%存活，菌落形態(tài)特征無明顯改變且生長良好。

2.4 2009年3月保存3株標準菌株，分別是銅綠假單胞菌（ATCC 27853）、大腸埃希菌（ATCC 25922）、肺炎克雷伯菌肺炎亞種（GY2000），經(jīng)1個月、3個月、6個月、1年、2年5個時間段用營養(yǎng)肉湯復蘇移種血平皿上經(jīng)35℃培養(yǎng)18～24h存活率均為100%，細菌的生長特性、形態(tài)染色特征無明顯變化，其中銅綠假單胞菌（ATCC 27853）、大腸埃希菌（ATCC 25922）2株標準菌株在保存到1年（2010年10月31日）和2年（2011年11月25日）時用Phoein100全自動細菌鑒定儀，45項生化反應2次檢測結果完全相同，說明2株標準菌株在保存2年后，其生化反應特性沒有發(fā)生改變。藥敏試驗2次試驗結果也完全相同，結果見表1。

3 討 論

用濾紙法保存的22株非苛養(yǎng)菌及5株酵母樣真菌在保存2年后其存活率均為100%，菌落形態(tài)特征無明顯改變且生長良好?？琉B(yǎng)菌中肺炎鏈球菌在保存2年時均100%存活，血平皿上菌落形態(tài)特征無明顯改變，觸酶試驗、膽汁溶菌試驗均為陽性，在2年時生長稍欠佳，僅生長量減少，可能有部分菌種死亡，其他特征無明顯改變；腦膜炎奈瑟菌、流感嗜血桿菌保存半年均100%存活，在巧克力平皿上菌落形態(tài)特征無明顯改且生長良好；淋球菌在保存1個月后就已經(jīng)死亡。對于苛養(yǎng)菌株，除對溫度比較敏感的淋球菌不能用該方法保存外，肺炎鏈球菌存活時間長，存活率較高，也比較適合用該方法保存；腦膜炎奈瑟菌和流感嗜血桿菌，在短時間內存活較好，但長時間保存和對生物學特性的影響尚待進一步研究。

標準菌株銅綠假單胞菌（ATCC 27853）、大腸埃希菌（ATCC 25922）、肺炎克雷伯菌肺炎亞種（GY2000）用濾紙法保存近3年，存活率均為100%，菌落形態(tài)特征無明顯變化。銅綠假單孢菌（ATCC 27853）、大腸埃希菌（ATCC 25922）2株標準菌株經(jīng)Phoein100全自動細菌鑒定儀檢測，2年內生物學特性差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），藥物敏感性試驗少部分檢測值與參照值不完全相符，但2次檢測值相同，說明該方法保存2株標準菌株2年內是穩(wěn)定的，與參照值不符可能是實驗前的菌株變異造成的。實驗結果表明，濾紙保存法能滿足實驗室室內質控非苛養(yǎng)菌標準菌株的保存要求，同時也適合基礎實驗室保存一些用于教學的普通非苛養(yǎng)菌株。此方法無需特殊設備，操作簡單，經(jīng)濟實用。保存時間較長，有報道此法可保存銅綠假單胞菌5年甚至更長時間，并且菌種生物學特性穩(wěn)定，是一種適合于基層實驗室推廣應用的菌種保存方法。

[1] 劉英，王磊，吳紅艷，等.銅綠假單胞菌菌種濾紙保存法探討[J].中國病原生物學雜志，2009，4（9）：716－719.

[2] 葉晴，尹光琳.用真空冷凍干燥法保存微生物菌株[J].現(xiàn)代科學儀器，2000，12（4）：19－20.

[3] 葉應嫵，王毓三.全國臨床檢驗操作規(guī)程[M].2版.南京：東南大學出版社，1997：632.