唐橋斐

沈陽醫(yī)學(xué)院沈洲醫(yī)院耳鼻喉科，遼寧沈陽 110002

1 材料與方法

1.1 大鼠SOM模型建立

實(shí)驗(yàn)動物分組：入選標(biāo)準(zhǔn)：入選動物需滿足以下條件：鼓室壓≥-50 Dapa（1 Dapa=0.0098 Kpa，正常聲阻抗圖為A型曲線）；依次標(biāo)準(zhǔn)檢查后，8只SD大鼠被淘汰，2只不明原因死亡。70只SD大鼠分為3組。①實(shí)驗(yàn)組：即造模組，30只，右側(cè)中耳腔內(nèi)注射ET 35 μL；②對照組：30只，健康，雙耳未經(jīng)處置。③生理鹽水（NS）組：10只，右側(cè)中耳腔內(nèi)注射NS 35 μL；兩組左耳均作為正常對照。

動物處死及標(biāo)本采集：實(shí)驗(yàn)組術(shù)后6 h、1 d、7 d、3 d、14 d、對照組及NS組分別取了6只、5只動物深麻醉后先行心內(nèi)穿刺抽取血液0.5 mL，立即離心（3000 r/min）取上清液。斷頭并且暴露右側(cè)聽泡，找到穿孔部位用50 μL微量加樣器抽取中耳積液后，以25 μL NS沖洗聽泡3 次，將沖洗液與中耳滲液一起收集，并離心取上清液。將血液與中耳滲液標(biāo)本離心后的上清液于- 80 ℃凍存待檢。

1.2 免疫組化染色

主要試劑為兔抗大鼠TNF-α多克隆抗體及相應(yīng)的SP試劑盒。采用免疫組化SP，染色方法，步驟按說明書進(jìn)行。用PBS代替一抗作陰性對照，以排除非特異性染色。采用HAPIAS1000 彩色多媒體圖像分析系統(tǒng)對標(biāo)本切片的免疫組化染色結(jié)果進(jìn)行圖像定量分析。

以TNF-α在中耳黏膜上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞中的平均灰度值作為觀察指標(biāo)。以細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為TNF-α陽性細(xì)胞。進(jìn)行圖像定量分析的時(shí)候，在400倍視野下選取不相重疊的5個(gè)代表性的部位，測量上皮陽性細(xì)胞和血管內(nèi)的皮陽性細(xì)胞的灰度值，取它的均值為該標(biāo)本的測量結(jié)果。

1.3 ELISA方法檢測大鼠SOM模型各組TNF-α總蛋白含量

試劑和儀器：TNF-α ELISA檢測試劑盒，DG 3302酶聯(lián)免疫檢測儀。標(biāo)本的檢測：按照試劑盒提供的檢測方法開始進(jìn)行操作，繪制標(biāo)準(zhǔn)的曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的曲線各點(diǎn)來進(jìn)行回歸分析，從而得出回歸的方程Y=a+b……X (r=……，標(biāo)準(zhǔn)曲線在××～×× 106pg/mL的范圍內(nèi)回歸系數(shù)為0.××，符合上述回歸方程)，將樣品的OD 值代入公式并求出樣品中的TNF-α含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 11.0軟件包進(jìn)行分析，計(jì)量資料：統(tǒng)計(jì)描述：用（±s）；統(tǒng)計(jì)分析：成組數(shù)據(jù)的平均值比較，如方差齊用t檢驗(yàn)，如方差不齊用t＇-檢驗(yàn)；配對數(shù)據(jù)的平均值比較，用配對t-檢驗(yàn)；多組間比較采用F-檢驗(yàn)及兩兩比較q-檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料：統(tǒng)計(jì)描述：用百分率；統(tǒng)計(jì)分析：用χ2-檢驗(yàn)；相關(guān)資料：采用直線相關(guān)分析法；TNF-α和TNF soLRⅡ濃度統(tǒng)計(jì)，運(yùn)用Mikrowin軟件4參數(shù)回歸法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 普通病理染色觀察鼓室黏膜形態(tài)

①在ET組術(shù)之后，6 h中的耳黏膜上皮下間隙增厚，1 d時(shí)增厚更著并見炎性細(xì)胞浸潤，中耳腔可見炎性細(xì)胞滲出，主要是多形核中性的白細(xì)胞。3 d時(shí)上述改變達(dá)高峰。7 d只見上皮下間隙增厚，并且明顯有所減輕。14 d時(shí)基本上已經(jīng)恢復(fù)正常。②NS組未見明顯的異常變化。

2.2 免疫組化染色觀察結(jié)果

TNF-α在內(nèi)毒素注入6 h開始表達(dá)，隨后逐漸增高，于3 d時(shí)達(dá)高峰，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，1 d、3 d、7 d組與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），1 d與3 d，7 d與3 d組相比都有一定的意義（P＜0.05），14 d 、6 h組與正常組相之比較，沒有明顯性的差別。

2.3 ELISA方法檢測結(jié)果

TNF-α在內(nèi)毒素注入6 h時(shí)可以檢測，隨后蛋白含量逐漸增高，于3 d時(shí)達(dá)高峰。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，1 d、3 d、7 d組與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），1 d與3 d，7 d與3 d組分別比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），6 h、14 d組與正常組比較無顯著性差異。

3 討論

分泌性中耳炎是耳鼻喉科的常見病、多發(fā)病，一年四季、成年人及兒童均可發(fā)病，以中耳腔出現(xiàn)滲出液為主要特征。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）是CK中倍受人們關(guān)注的一種因子，它是機(jī)體炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答的重要調(diào)節(jié)因子。它的生物學(xué)活性包括了激活炎性細(xì)胞，加強(qiáng)WBC向炎癥局部滲出。

[1]李瑩.TNF-α與CD44在SD大鼠分泌性中耳炎的表達(dá)及意義[D].瀘州醫(yī)學(xué)院，2011.

[2]李希平，趙守琴.腫瘤壞死因子-α在分泌性中耳炎動物模型中的表達(dá)[J].中國醫(yī)學(xué)文摘（耳鼻咽喉科學(xué)）.2006（1）.