王小林 薛 靜

（河南省醫(yī)藥學(xué)校，河南 開(kāi)封 475000）

瘋牛病（BSE）是發(fā)生在成年牛的一種慢性進(jìn)行性高致死性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，屬人獸共患病。自1985年在英國(guó)發(fā)現(xiàn)以來(lái)，現(xiàn)已波及30多個(gè)國(guó)家和地區(qū)。由瘋牛病引發(fā)的公共衛(wèi)生問(wèn)題、社會(huì)經(jīng)濟(jì)和政治問(wèn)題已超過(guò)瘋牛病本身。瘋牛病以其病原超強(qiáng)的抵抗力、傳播方式的特殊性、超長(zhǎng)的潛伏期和高致死性正在成為有史以來(lái)對(duì)人類威脅最大的傳染病之一。瘋牛病主要通過(guò)食物鏈傳播，是由于牛食用了含有朊病毒的肉骨粉飼料所致，禁止含牛羊源性成分飼料的生產(chǎn),流通,使用,成為預(yù)防瘋牛病感染,流行的主要手段之一。對(duì)飼料中牛羊源性成分的檢測(cè)具有重要的意義[2]。本方法的最低檢出限為0.25%。

1 儀器，試劑與樣品

1.1 儀器

1.1.1 高壓滅菌鍋

1.1.2 離心機(jī)(micromax型,美國(guó)Thermo公司)

1.1.3 迷你旋渦混合器(minishaker)

1.1.4 水浴鍋

1.1.5 PCR儀(T-Gradient Thermoblock,德國(guó)Biometra公司)

1.1.6 電泳儀(PowerPace universal,Biorad公司)

1.1.7 凝膠電泳成像系統(tǒng)(GelDoc XR型,Biorad公司)

1.2 試劑[3]

除另有規(guī)定外，試劑為分析純或生化試劑，水為滅菌雙蒸水。

1.2.1 動(dòng)物源性植

1.2.2 物飼料基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)

1.2.3 電泳緩沖液:稱取 54 g Tris,27.5 g硼酸,20 mL EDTA溶液,然后用水定容到 1 L,使用時(shí)10倍

1.2.4 稀釋 Tris:tris(hydroxymethyl)aminomethane，

1.2.5 三(羥甲基)氨基甲烷,EDTA:ethylene diaminetetraacetic acid，

1.2.6 乙二胺四乙酸。

1.2.7 10mg/mL溴化乙錠溶液

1.2.8 瓊脂糖 電泳純。

1.2.9 25 umol/L引物溶液

1.2.10 Taq DNA 聚合酶(5U/μL)Taq:Thermus aquaticu，

1.2.11 水生棲熱菌

1.2.12 各10mmol/L的四種脫氧核糖核甘酸混合液 (dNTP:dATP、dTTP、dCTP、dGTP)

1.2.13 DNA分子量標(biāo)

1.2.14 記物 100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp （大連寶生物）

1.3 樣品

從各地抽檢的16種飼料做牛羊源性成分檢測(cè)，同時(shí)作陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照，空白對(duì)照。

陰性對(duì)照:不含?；蜓虺煞值娘暳现刑崛〉腄NA作為PCR反應(yīng)的DNA模板；

陽(yáng)性對(duì)照:含?；蜓虺煞值娘暳现刑崛〉腄NA作為PCR反應(yīng)體系的模板；

空白對(duì)照:用無(wú)菌重蒸餾水作為PCR反應(yīng)體系的模板。

2 方法

2.1 飼料中牛羊DNA的提取

取50mg研磨粉碎的動(dòng)物源性飼料于離心管，依所用試劑盒中的操作提取DNA。如下:向管中加320μL緩沖液GA，振蕩；加20μL(20mgml-1)蛋白酶，混勻，65℃水浴 30min；加 340μL 緩沖液 GB，混勻，水浴10min；12000rmp離心2min，取上清液400μL于新管，向上清中加200μL無(wú)水乙醇混勻，將其全部加入一個(gè)吸附柱CB3中 （有收集管），離心2min倒掉廢液，放回收集管中；加500μL去蛋白液GD離心30s，倒掉廢液，將吸附柱放回。再用漂洗液PW700μL，500μL分別洗吸附蛀，離心30秒，倒掉廢液，放回收集管；空離心2min后，室溫放數(shù)分鐘，將吸附柱轉(zhuǎn)入一新的離心管，加200μL洗脫液TE，放5min，離心 2min。 TE:Tris-Cl、EDTA 緩沖液。

2.2 PCR 反應(yīng)

向 200μLPCR 反應(yīng)管中依次加入 10×PCR 緩沖液 5μL，1μL 各10mmolL-1的四種脫氧核糖核甘酸混合液，引物溶液（含正向和反向引物）各 1μL，摸板 DNA10μL Taq DNA 聚合酶 1μL，加入滅菌水,使反應(yīng)體系達(dá)50μL。以4000r/min離心10s后，PCR擴(kuò)增，95℃恒溫1～3min；30次擴(kuò)增反應(yīng)循環(huán)（95℃恒溫30～60s，56℃恒溫 30～60s，72℃恒溫 30～60s）；然后72℃恒溫5min，取出PCR反應(yīng)管。

2.3 PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)

取 3g瓊脂糖加入200mL電泳緩沖液，加熱溶解，稍冷加12μL的EB混勻，倒膠，冷凝。在電泳槽中加入電泳緩沖液，使液面剛剛沒(méi)過(guò)凝膠。將5μL～8μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別和適量加樣緩沖液混合，點(diǎn)樣。9V／cm恒壓，電泳30min，結(jié)束后將凝膠置于凝膠成像儀上成像，拍照。

3 結(jié)果

對(duì)所抽取的16個(gè)樣品做牛羊源性成分的檢測(cè)結(jié)果如下。每個(gè)樣品均做平行樣，前四個(gè)分別為M，陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照，空白對(duì)照。

在飼料中牛源性成分的檢測(cè)中，飼料編號(hào)為S2007C0254，S2007C0372，S2007C0374的三個(gè)中檢出結(jié)果為陽(yáng)性。

在飼料中羊源性成分的檢測(cè)中，飼料編號(hào)為S2007C0254，S2007C0372的兩個(gè)中檢出結(jié)果為陽(yáng)性。

4 討論

4.1 所取飼料要粉碎，顆粒大小在0.125mm以下；在DNA提取中，振蕩至徹底懸浮，且溫浴期間離心管底出現(xiàn)沉淀時(shí)也要將其振蕩至徹底懸??；在樣品的水浴過(guò)程中，其間要混勻樣品2-3次；上清液與無(wú)水乙醇的體積比為1:2；空離心后放置數(shù)分鐘，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的殘留會(huì)影響后續(xù)的酶反應(yīng)實(shí)驗(yàn)；洗脫液TE的體積不少于50μL，體積過(guò)小影響回收效率。

4.2 PCR反應(yīng)儀有邊緣效應(yīng)，應(yīng)把PCR反應(yīng)管放中間位置，且PCR反應(yīng)管要蓋緊，否則會(huì)污染PCR儀。

4.3 在電泳的配膠加入溴化乙錠溶液時(shí)，要帶一次性手套。EB有致癌作用。

在整個(gè)操作過(guò)程中要注意防止交叉污染，嚴(yán)格操作。

［1］飼料中牛羊源性成分的定性檢測(cè).GB/T 20190-2006定性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）法[S].

［2］瘋牛病的醫(yī)藥途徑性潛伏危害及建立相關(guān)檢測(cè)方法的迫切性[J].中國(guó)藥事，2002，16（4）.

［3］SN/T 1119-2002進(jìn)出口動(dòng)物源性飼料中牛羊源性成分檢測(cè)方法 PCR方法[S].中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社.