胡仁建，蔡家利△，劉 利，涂漫語(yǔ)，徐 濤，杜翠容，羅 佳，丁 森

（1.重慶理工大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院 400054；2.南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 210093）

高危型人乳頭狀瘤病毒（human papilloma virus，HPV）持續(xù)感染宮頸是引起宮頸癌及癌前病變的直接病因［1］。HPVE7蛋白為宮頸癌發(fā)展的潛在標(biāo)志物，可以用新型雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法檢測(cè)到各型HPV的重組E7蛋白以及宮頸涂片和宮頸癌細(xì)胞裂解物中的HPVE7蛋白［2］。HPV很難在體外培養(yǎng)成功［3－5］，HPV18整合在 HeLa細(xì)胞株的染色體［3，6］，本研究利用基因重組技術(shù)，構(gòu)建 HPV18E7基因的重組質(zhì)粒，并探索HPV18E7基因的優(yōu)化表達(dá)，為探索新的簡(jiǎn)單有效的檢測(cè)宮頸涂片中的HPV18E7蛋白的診斷方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和材料 大腸桿菌DH5α和BL21－DE3－pLysS由重慶市富進(jìn)生物技術(shù)有限公司惠贈(zèng)，組織／細(xì)胞DNA小量抽提試劑盒購(gòu)于上海華舜生物技術(shù)有限公司，質(zhì)粒抽提試劑盒和膠回收試劑盒購(gòu)于OMEGA公司，質(zhì)粒載體pET－32a（＋）購(gòu)于Novagen公司，HPV18E7引物委托上海博尚生物技術(shù)有限公司合成，工具酶PrimeSTARRHS DNA Polymerase、NcoⅠ、XhoⅠ、T4DNA Ligase等購(gòu)于大連寶生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要儀器 Thermo Hybaid公司的2×P梯度PCR儀，BIO－RAD電泳儀及電泳槽等。

1.2 方法

1.2.1 pET－32a（＋）－HPV18E7重組質(zhì)粒的構(gòu)建 利用軟件分析HPV18E7全基因的序列后設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物。以提取的HeLa細(xì)胞株的DNA為模板PCR擴(kuò)增HPV18E7基因。將HPV18E7基因和載體pET－32a（＋）進(jìn)行酶切及連接。

1.2.2 感受態(tài)細(xì)胞的制備與重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化 用氯化鈣法制備DH5的感受態(tài)細(xì)胞，將連接后的重組質(zhì)粒pET－32a（＋）－HPV18E7轉(zhuǎn)化感受態(tài)的大腸桿菌DH5α，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.3 重組質(zhì)粒的鑒定 挑選3個(gè)單菌落，提取質(zhì)粒，進(jìn)行了PCR鑒定、雙酶切鑒定和DNA測(cè)序。

1.2.4 HPV18E7基因在大腸桿菌中的優(yōu)化表達(dá) 在LB培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)起始A600為0.6～0.8，用異丙基－β－D－硫代吡唃半乳糖苷（IPTG）和乳糖兩種誘導(dǎo)劑，IPTG誘導(dǎo)濃度分別為0.1、0.2、0.5、1.0mmol／L，乳糖濃度0.10、0.25、0.50、1.00g／L，4個(gè)誘導(dǎo)溫度：20、24、30、37℃，以空載體為空白對(duì)照，誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后2、4、6h取樣，所有的十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酶胺凝膠（SDS－PAGE）電泳結(jié)果顯示目的蛋白的表達(dá)量不高。據(jù)F.William Studier的自誘導(dǎo)策略的成功［7］，嘗試用為自誘導(dǎo)培養(yǎng)基ZYM－5052時(shí)，結(jié)果顯示有大量的目的蛋白表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1 HPV18E7基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果 梯度PCR結(jié)果顯示除64.2℃的退火溫度不能擴(kuò)增出目的基因以外，退火溫度分別為：64.5、65.1、65.7、66.5、67.3、68.1、69.0、69.6、69.9、70.1℃均能擴(kuò)增出與目標(biāo)基因HPV18E7（大小為318bp）大小一致的片段，且特異性較好，無(wú)其他雜帶的出現(xiàn)。見圖1。選擇69℃為退火溫度大量PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因HPV18E7。

圖1 HPV18E7基因的梯度PCR擴(kuò)增核酸電泳圖

2.2 重組質(zhì)粒pET－32a（＋）－HPV18E7的PCR鑒定 以3個(gè)克隆的重組質(zhì)粒pET－32a（＋）－HPV18E7為模板，用HPV18E7特異性引物PCR擴(kuò)增HPV18E7基因，有3個(gè)克隆的重組質(zhì)粒能夠擴(kuò)增出相對(duì)分子質(zhì)量大小與HPV18E7基因一致的條帶，見圖2。

圖2 重組質(zhì)粒pET－32a（＋）－HPV18E7的PCR鑒定圖

2.3 重組質(zhì)粒pET－32a（＋）－HPV18E7的雙酶切鑒定 用NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切3個(gè)經(jīng)PCR鑒定有目標(biāo)基因的重組質(zhì)粒pET－32a（＋）－HPV18E7，核酸電泳顯示有與質(zhì)粒pET－32a（＋）和目標(biāo)基因HPV18E7的相對(duì)分子質(zhì)量大小一致的條帶出現(xiàn)。見圖3。

2.4 重組質(zhì)粒pET－32a（＋）－HPV18E7的DNA測(cè)序 先將3個(gè)經(jīng)PCR鑒定和雙酶切鑒定有目的基因的重組質(zhì)粒pET－32a（＋）－HPV18E7送大連寶生物公司測(cè)序，有2個(gè)質(zhì)粒中HPV18E7序列與HeLa細(xì)胞中的HPV18E7序列一致，有1個(gè)質(zhì)粒有1個(gè)堿基變異。另外提取3個(gè)質(zhì)粒，DNA測(cè)序，經(jīng)比對(duì)后發(fā)現(xiàn)這3個(gè)質(zhì)粒中的目標(biāo)基因HPV18E7的序列與模板HeLa細(xì)胞中的HPV18E7序列一致。選擇其中任何一個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)的大腸桿菌BL21－DE3－pLysS制備成工程菌用于表達(dá)HPV18E7致癌蛋白。

圖3 重組質(zhì)粒pET－32a（＋）－HPV18E7的雙酶切鑒定

圖4 用IPTG和乳糖誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)無(wú)明顯的HPV18E7融合蛋白出現(xiàn)的SDS－PAGE圖

2.5 重組質(zhì)粒pET－32a（＋）－HPV18E7在大腸桿菌中的優(yōu)化表達(dá) 在LB培養(yǎng)基中，用IPTG和乳糖，在不同溫度、不同誘導(dǎo)劑濃度、不同時(shí)間等任何一個(gè)條件誘導(dǎo)，然后經(jīng)SDS－PAGE電泳，結(jié)果顯示均無(wú)明顯的目的蛋白出現(xiàn)。見圖4。在自誘導(dǎo)培養(yǎng)基ZYM－5052中，選擇4個(gè)誘導(dǎo)溫度20℃、24℃、30℃、37℃，任何一個(gè)溫度的SDS－PAGE蛋白電泳顯示：與空載體pET－32a（＋）－BL21－DE3－pLysS相比，pET－32a（＋）－HPV18E7－BL21－DE3－pLysS誘導(dǎo)前即0h、誘導(dǎo)2h未見與目標(biāo)蛋白相對(duì)分子質(zhì)量大小一致的條帶，4h均開始出現(xiàn)新的相對(duì)分子質(zhì)量約33×103的條帶，誘導(dǎo)18h的量明顯多于誘導(dǎo)4h的量，HPV18E7融合蛋白出現(xiàn)在上清中，顯示HPV18E7基因表達(dá)的融合蛋白為可溶性表達(dá)，見圖5?？蛰d體pET－32a（＋）表達(dá)的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約為20×103，HPV18E7蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量約為13×103，重組質(zhì)粒pET－32a（＋）－HPV18E7表達(dá)的融合蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量大約33×103，正好與新出現(xiàn)的條帶相對(duì)分子質(zhì)量一致。

經(jīng)硫酸鎳親和層析初步純化HPV18E7融合蛋白（因?yàn)檩d體pET－32a（＋）本身帶有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽，可以與硫酸鎳結(jié)合），SDS－PAGE蛋白電泳顯示用含50mmol／L咪唑和75 mmol／L咪唑的洗脫液不能洗脫表達(dá)的融合蛋白，用含200 mmol／L咪唑和500mmol／L咪唑的洗脫液可以洗脫，加上相對(duì)分子質(zhì)量與目標(biāo)蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量一致，說(shuō)明500 mmol／L咪唑洗脫的蛋白為目標(biāo)融合蛋白。見圖6。

圖5 ZYM－5052誘導(dǎo) pET－32a（＋）－HPV18 E7－BL21－DE3－pLysS表達(dá)圖

圖6 硫酸鎳親和層析初步純化HPV18E7融合蛋白的電泳圖

3 討 論

3.1 重組質(zhì)粒pET－32a（＋）－HPV18E7的構(gòu)建構(gòu)建HPV18E7基因時(shí)，設(shè)計(jì)針對(duì)HPV18E7全長(zhǎng)基因的特異引物，目的是希望獲得HPV18E7全長(zhǎng)天然蛋白，以此天然蛋白篩選的單抗能更好特異結(jié)合宮頸涂片中表達(dá)的天然的HPV18E7蛋白。選擇載體pET－32a（＋）是因?yàn)樗鼛в蠺7強(qiáng)啟動(dòng)子、帶有融合標(biāo)簽（Trx.Tag、His.Tag、S.Tag等）可使目的HPV18E7蛋白可溶性的持續(xù)性表達(dá)，而且在設(shè)計(jì)引物時(shí)使表達(dá)的初始2個(gè)氨基酸（蛋氨酸和纈氨酸）為非極性氨基酸時(shí)會(huì)提高表達(dá)量。采用梯度PCR探索出最佳的退火溫度并大量擴(kuò)增特異HPV18E7基因，為后續(xù)的酶切、連接、鑒定等奠定基礎(chǔ)。特別強(qiáng)調(diào)的是在回收PCR產(chǎn)物、酶切后的產(chǎn)物時(shí)一定要迅速，避免在紫外線下暴露時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)引起的點(diǎn)突變。

3.2 重組質(zhì)粒pET－32a（＋）－HPV18E7的優(yōu)化表達(dá)探索pET表達(dá)系統(tǒng)為T7誘導(dǎo)系統(tǒng)，用IPTG誘導(dǎo)存在不足［8］。本研究實(shí)驗(yàn)證明，在LB培養(yǎng)中，用IPTG誘導(dǎo)HPV18E7基因，無(wú)論選用哪種溫度、何種誘導(dǎo)濃度、何種起始量，以及誘導(dǎo)時(shí)間長(zhǎng)短都未見有HPV18E7融合蛋白的明顯表達(dá)；用傳統(tǒng)的乳糖誘導(dǎo)方法無(wú)論在哪種條件下，都未見有HPV18E7基因的明顯表達(dá)。美國(guó)布魯克黑文實(shí)驗(yàn)室的Studier提出了自誘導(dǎo)表達(dá)策略這一理論并實(shí)踐成功［7］。彭淑英等［9］啟用自誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)提高了表達(dá)的效率。本研究采用了Studier的自誘導(dǎo)不固定型組分培養(yǎng)基ZYM－5052，的確獲得大量的呈可溶性表達(dá)的HPV18E7融合蛋白，大大超過用IPTG和乳糖誘導(dǎo)的結(jié)果，再次證明了自誘導(dǎo)表達(dá)策略的確可以提高外源基因在原核系統(tǒng)的表達(dá)效率。

培養(yǎng)基ZYM－5052包含細(xì)菌生長(zhǎng)的各種營(yíng)養(yǎng)成分和自誘導(dǎo)因素，包括葡萄糖和乳糖，葡萄糖消耗完畢后乳糖誘導(dǎo)作用開始。使用自誘導(dǎo)培養(yǎng)基ZYM－5052操作簡(jiǎn)單，表達(dá)效率高，價(jià)格便宜，易于推廣。

后續(xù)的純化實(shí)驗(yàn)表明表達(dá)的融合蛋白可以用硫酸鎳親和層析純化得到，且相對(duì)分子質(zhì)量的大小與HPV18E7融合的相對(duì)分子質(zhì)量大小一致，證實(shí)了表達(dá)的融合蛋白確實(shí)是目標(biāo)蛋白。初次純化的HPV18E7蛋白的純度雖然遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，但可以通過提高硫酸鎳親和層析柱的柱效以得到純度高的融合蛋白，為后續(xù)的腸激酶酶切HPV18E7融合蛋白奠定基礎(chǔ)。

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