高瑩瑩，高海燕，王一凡，吳任綺

(上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海，200444)

臭豆腐為中國(guó)傳統(tǒng)豆制品，因其營(yíng)養(yǎng)豐富，風(fēng)味獨(dú)特在中國(guó)乃至全世界得到廣泛流傳［1］。根據(jù)生產(chǎn)工藝不同，臭豆腐可分為發(fā)酵型臭豆腐和非發(fā)酵型臭豆腐。發(fā)酵型臭豆腐在北方比較普遍，又稱臭豆腐乳，以著名的王致和臭豆腐為代表。非發(fā)酵型臭豆腐又稱油炸臭豆腐，以長(zhǎng)沙火宮殿臭豆腐為代表，儲(chǔ)存期較短，一般為3 ～5 天。

目前，對(duì)臭豆腐的研究包括營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、生產(chǎn)過(guò)程存在的安全問(wèn)題、風(fēng)味物質(zhì)以及臭豆腐鹵中微生物多樣性的研究等［1-10］。受傳統(tǒng)加工工藝和實(shí)際生產(chǎn)的制約，非發(fā)酵型臭豆腐仍存在許多質(zhì)量和安全問(wèn)題。如在銷售存放期間經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)表面變紅的現(xiàn)象，炎熱的夏天該現(xiàn)象更為嚴(yán)重。一旦變紅，臭豆腐便不能再食用。但迄今為止，針對(duì)非發(fā)酵型臭豆腐的變紅問(wèn)題，尚無(wú)系統(tǒng)的科學(xué)研究，本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，引起此現(xiàn)象的原因與鹵液中的微生物有關(guān)。因此，本論文擬從食品安全和實(shí)際生產(chǎn)的角度出發(fā)，從物理?xiàng)l件、化學(xué)防腐劑、植物提取物及生物抑制等幾個(gè)角度對(duì)該變質(zhì)現(xiàn)象的控制進(jìn)行研究，旨在提高非發(fā)酵型臭豆腐的儲(chǔ)存期，降低因變紅變質(zhì)導(dǎo)致的浪費(fèi)，為提高非發(fā)酵型臭豆腐的質(zhì)量安全提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

變紅臭豆腐、豆坯、鹵(市售)，雙乙酸鈉、山梨酸鉀、丙酸鈣(食用級(jí))，甘草、丁香、大黃(上海藥店)，大蒜(市售)，生防拮抗菌CF-2 和CF -3，由上海大學(xué)生命學(xué)院食品科學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 儀器與設(shè)備

立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;THZ-C 恒溫振蕩器，太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;CHA-213 型雙目生物顯微鏡，日本PLYMPUS 儀器有限公司;756 CRT 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司;RE -3000A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海振捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 腐敗菌的分離、提純及反接

取臭豆腐變紅表皮打碎過(guò)濾，濾液用生理鹽水按10-2～10-7依次稀釋。取100 μL 各濃度的稀釋液接種于牛肉膏蛋白胨(BP)固體培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)24 h。將篩選得到的腐敗菌制成菌懸液，按0.1%的體積分?jǐn)?shù)加入已滅菌的鹵液中，取新鮮豆坯浸鹵4 h，常溫放置12 h 后，觀察其表面腐敗現(xiàn)象是否與生產(chǎn)中變紅豆坯相一致，從而確定該菌株是否為導(dǎo)致非發(fā)酵型臭豆腐表皮變紅的腐敗菌株(CR)。

1.3.2 菌懸液的制備

無(wú)菌挑取1 環(huán)CR菌苔接種于BP 培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)24 h，取少量菌苔接種于BP 液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)24 h，取滅菌生理鹽水將其稀釋為106CFU/mL 的菌懸液，備用。

1.3.3 抑制劑的制備

配置濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g/kg 的雙乙酸鈉、山梨酸鉀及丙酸鈣溶液，滅菌，4 ℃保存;采用水煎法［11］配置丁香、大黃和甘草提取原液(相當(dāng)于生藥量1.0 g/mL);以水蒸汽蒸餾法提取大蒜原液(相當(dāng)于生藥量1.0 g/mL)［12-13］。將提取原液分別稀釋至質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.20、0.10、0.07、0.05、0.04 g/mL，滅菌，4 ℃保存。

1.3.4 腐敗菌的抑制

物理抑制:取對(duì)數(shù)期的CR分別于4、16、22、28、37 、55 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)定吸光度;調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH 值分別為5.0、6.0、7.0、8.0，NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2.5%、5.0%、7.5%、10%、12.5%、15%、20%，取100 μL 菌懸液接種至不同pH 和不同NaCl 濃度的BP 液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌種生長(zhǎng)狀況。

化學(xué)及植物抑制:采用稀釋混合平板法制備檢測(cè)培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基(上、下層)均凝固后，將牛津杯垂直放置于培養(yǎng)基表面，杯中加入150 μL 不同濃度的化學(xué)防腐劑及植物提取液，30 ℃培養(yǎng)24 h，十字交叉法測(cè)定抑菌圈大小。

生物抑制:稀釋混合平板法制備檢測(cè)培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基(上、下層)均凝固后，取菌落直徑0.7 cm 的培養(yǎng)48 h 的生防拮抗菌CF-2 和CF-3 菌餅置于培養(yǎng)基中央，滅菌的BP 固體培養(yǎng)基菌餅做對(duì)照。30℃培養(yǎng)24 h，測(cè)定菌餅周圍的抑菌圈大小。

1.3.5 臭豆腐變紅的抑制

篩選在CR抑制中有明顯抑制效果的處理及水平，結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)要求，以豆坯為研究對(duì)象，測(cè)定常溫保存48 h 后的未變紅率。

未變紅率測(cè)定:通過(guò)游標(biāo)卡尺測(cè)量實(shí)驗(yàn)各組豆坯的表面積，計(jì)算出豆坯暴露于空氣中的總表面積(S1)和未變紅部分的面積(S2)，計(jì)算未變紅率:

1.3.6 實(shí)際生產(chǎn)中的抑制

根據(jù)1.3.5 對(duì)臭豆腐變紅的抑制研究結(jié)果，采用各種抑制方法并將其互相組合，應(yīng)用于非發(fā)酵型臭豆腐的模擬生產(chǎn)中，與空白組進(jìn)行對(duì)照，記錄臭豆腐出現(xiàn)變紅的時(shí)間。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

重復(fù)測(cè)定3 次，結(jié)果以χ ±SD 表示，采用SPSS(Version16. 0)軟件進(jìn)行方差分析和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅色腐敗菌的分離與反接

實(shí)驗(yàn)中分離得到1 株紅色細(xì)菌，將其反接于新鮮豆腐表面，豆坯出現(xiàn)與實(shí)際生產(chǎn)中相一致的腐敗變紅現(xiàn)象，從而確定該菌為導(dǎo)致豆坯表皮變紅的腐敗菌CR。該菌只在培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)，菌落圓形，直徑約2 mm，邊緣平滑，不透明，凸起，顏色呈粉紅色到紅色(紅色的深淺與培養(yǎng)時(shí)間成正相關(guān))。

2.2 對(duì)腐敗菌CR 的抑制

2.2.1 物理抑制

CR屬好氧菌，無(wú)氧狀態(tài)下生長(zhǎng)受到抑制。由圖1 可知，在22 ～37 ℃條件下培養(yǎng)的CR生長(zhǎng)情況良好，低溫(4 ℃)和高溫(55 ℃)條件下，CR的生長(zhǎng)受到明顯的抑制。pH 5.0 ～8.0 的范圍內(nèi)，CR均可以正常生長(zhǎng)，抑制效果不顯著。耐鹽性實(shí)驗(yàn)顯示，低鹽(＜2.5%)或者極度高鹽(＞12.5%)的環(huán)境中，該菌的生長(zhǎng)受到抑制(表1)。

圖1 不同溫度及pH 條件下CR 的生長(zhǎng)Fig.1 Growing state of CR under different temperature and pH

表1 CR 在不同的NaCl 濃度下的生長(zhǎng)狀況Table 1 Growing state of CR in different sodium chloride concentration

2.2.2 化學(xué)防腐劑抑制

根據(jù)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)［14］，選取豆制品中允許使用的3 種防腐劑及其最大濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，由表2可以看出，3 種防腐劑對(duì)CR生長(zhǎng)的抑制差異顯著(P ＜0.01)，其中雙乙酸鈉的抑制效果最明顯。CR抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，雙乙酸鈉在0.5 ～2.5 g/kg 對(duì)CR菌有較好的抑制效果，且隨濃度增大抑菌效果呈緩慢上升趨勢(shì)(圖2)。

表2 不同防腐劑對(duì)CR 菌的抑菌活性Table 2 Inhibition effects on CR of different preservatives

圖2 雙乙酸鈉對(duì)CR 的抑菌活性Fig.3 Inhibition effects of sodium diacetate on CR

2.2.3 植物提取液抑制

由表2 可知，質(zhì)量濃度為0.20 g/mL 的4 種植物提取液對(duì)CR菌的抑制具有極顯著差異(P ＜0.01)。丁香和大黃提取物抑菌率相對(duì)較高，甘草和大蒜對(duì)CR菌的生長(zhǎng)幾乎沒(méi)有抑菌，其中丁香提取物對(duì)CR菌的抑菌效果顯著高于其他3 種植物提取物。對(duì)不同濃度丁香提取物對(duì)CR的抑菌效果進(jìn)行研究，從圖3 可看出，丁香濃度增加，抑菌率也隨之增加。

表3 不同植物提取液對(duì)CR 的抑菌活性Table 3 Antibacterial activity of different plant extract against CR

2.2.4 生物抑制

圖3 不同濃度丁香提取物對(duì)CR 的抑制效果Fig.3 Antibacterial activity of different concentration of Flos Caryophlli against CR

生防拮抗菌CF-2 和CF-3 對(duì)CR的抑制具有顯著差異(P ＜0.05)。由表4 可見(jiàn)，兩種拮抗菌對(duì)CR均有抑制作用，且CF-2 的抑制效果要明顯優(yōu)于CF-3。

表4 生防菌對(duì)CR 的抑制效果Table 4 Inhibition effects of biocontrol bacteria

2.3 對(duì)臭豆腐變紅現(xiàn)象的抑制研究

由表5 可知，抽真空包裝處理的豆坯未變紅率達(dá)到100%。不同溫度下儲(chǔ)存豆坯，對(duì)變紅現(xiàn)象的抑制具顯著差異(P ＜0.01)，4 ℃儲(chǔ)存豆坯未變紅率為100%。不同NaCl 濃度的鹵浸泡后各組之間變紅現(xiàn)象差異顯著(P ＜0.01)，其中，20%和15% NaCl 濃度抑制效果最佳，其次是12.5%和2.5%，與2.2.1 對(duì)CR抑制結(jié)果相符。由感官檢驗(yàn)小組進(jìn)行油炸品嘗，20%、15%、12.5%NaCl 濃度的臭鹵浸泡過(guò)的臭豆腐咸度超出普通消費(fèi)者的接受范圍。結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)鹵液中有益菌對(duì)NaCl 生長(zhǎng)需求，得出低鹽(≤2.5%)浸泡、低溫儲(chǔ)存或真空包裝均可對(duì)其變紅現(xiàn)象進(jìn)行有效控制，同時(shí)不影響其風(fēng)味。

采用含不同濃度雙乙酸鈉的鹵浸泡過(guò)的豆坯變紅現(xiàn)象受到不同程度的抑制，差異顯著(P ＜0.01)。隨雙乙酸鈉濃度增大豆坯未變紅率逐漸降低，與2.2.2 對(duì)CR抑制效果一致。結(jié)合《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》［14］中豆制品中防腐劑的使用規(guī)范，在生產(chǎn)中對(duì)臭豆腐中的紅色腐敗現(xiàn)象進(jìn)行控制時(shí)，采用含1.0 g/kg 雙乙酸鈉的鹵液浸泡臭豆腐，可明顯控制變紅現(xiàn)象。

添加不同濃度大黃提取液的鹵浸漬過(guò)的豆坯均呈現(xiàn)較深大黃顏色，破壞臭豆腐本身色澤。添加0.07 ～0.20 g/mL 的丁香提取液，臭豆腐變紅比例明顯降低，差異顯著(P ＜0.01)。隨丁香提取液濃度增大未變紅率比例逐漸降低，與2.2.3 對(duì)CR抑制試驗(yàn)結(jié)果相一致。結(jié)合浸鹵后的豆坯顏色，在生產(chǎn)中添加0.07 g/mL 丁香提取液，可有效降低臭豆腐變紅率，同時(shí)不影響豆坯顏色。

向鹵液中接種生防菌CF-2 和CF-3 后進(jìn)行豆坯的浸鹵，常溫(30 ℃)下放置48 h 內(nèi)，幾乎沒(méi)有豆坯出現(xiàn)變紅，腐敗現(xiàn)象得到有效地控制。

表5 臭豆腐腐敗的抑制Table 5 Inhibition of stinky tofu corruption

2.4 生產(chǎn)中臭豆腐變紅現(xiàn)象的抑制

根據(jù)2.2 和2.3 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將對(duì)臭豆腐變紅現(xiàn)象抑制較好的幾種方法相結(jié)合應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中(表6)。由于非發(fā)酵型臭豆腐在一定的時(shí)間內(nèi)會(huì)出現(xiàn)變酸腐敗，屬短期保存的日銷產(chǎn)品，因此結(jié)合生產(chǎn)銷售的實(shí)際情況，若臭豆腐在48 h 內(nèi)不出現(xiàn)變紅即可認(rèn)為達(dá)到保存要求。如表6 所示，抽真空包裝效果最為顯著，不僅不出現(xiàn)變紅，且變酸腐敗的速度也有明顯降低，但生產(chǎn)成本相應(yīng)的需要提高很多;低溫條件下進(jìn)行添加或不添加抑制劑均可達(dá)到48 h 內(nèi)不出現(xiàn)變紅的現(xiàn)象;常溫保存，結(jié)合1.0 g/kg 的雙乙酸鈉和0.07 g/ml 丁香提取液可達(dá)到48 h 內(nèi)不出現(xiàn)變紅的要求，生產(chǎn)成本相對(duì)比低溫或抽真空要低;接種CF-2 或CF-3 的抑制效果也很顯著，實(shí)驗(yàn)后期應(yīng)繼續(xù)對(duì)CF-2 和CF-3 的生理生長(zhǎng)以及毒理學(xué)特性進(jìn)行研究，方可進(jìn)行生產(chǎn)中投入使用。

表6 生產(chǎn)中的變紅現(xiàn)象的抑制Table 6 Inhibition of red corruption in production

3 結(jié)論

(1)從非發(fā)酵型臭豆腐腐敗表皮中分離得到1株紅色細(xì)菌，經(jīng)反接實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其為引起臭豆腐變紅腐敗的病原菌CR，該菌好氧，需鹽。

(2)抑制實(shí)驗(yàn)顯示，低溫(4 ℃)，真空包裝，1.0 g/kg 雙乙酸鈉、0.07 g/mL 丁香提取液以及本實(shí)驗(yàn)室中保存的生防拮抗菌CF -2 和CF -3，對(duì)CR菌的生長(zhǎng)均具有良好的抑制效果。

(3)實(shí)際生產(chǎn)中在鹵液中同時(shí)添加1.0 g/kg 雙乙酸鈉和0.07 g/mL 丁香提取液，可將常溫保存貨架期延長(zhǎng)至48 h，低溫(4 ℃)保存貨架期延長(zhǎng)至72 h以上，經(jīng)濟(jì)成本較低并且不會(huì)影響臭豆腐的品質(zhì)。

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