張娟紅，王榮，謝華，賈正平，，李文斌，謝希暉，（.蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院全軍高原損傷防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730050；.蘭州大學(xué)藥學(xué)院，蘭州 730050）

氨茶堿為茶堿和乙二胺的復(fù)合物，主要用于支氣管哮喘和喘息性支氣管炎，與受體激動(dòng)藥合用可提高療效。雖然許多新的抗哮喘藥物不斷涌現(xiàn)，但是氨茶堿仍是當(dāng)今最廣泛使用的抗哮喘藥物之一。其還可用于治療急性心功能不全和心源性哮喘、膽絞痛[1-2]，近年來還發(fā)現(xiàn)氨茶堿對急性缺氧動(dòng)物吸氧后再缺氧損傷有預(yù)防作用[3]。

目前，氨茶堿含量測定方法主要有高效液相色譜（HPLC）法[4-5]、毛細(xì)管電泳（CE）法[6]、拉曼光譜法[7]等?！吨袊幍洹?010年版[8]收載了氨茶堿片劑、注射劑及緩釋片的含量測定方法為紫外分光光度（UV）法，但此方法存在分析時(shí)間長、靈敏度低、輔料干擾多等缺點(diǎn)。隨著液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的逐步推廣，建立氨茶堿不同劑型超快速液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用（UFLC-MS/MS）法用于其質(zhì)量控制有著重要的意義。本試驗(yàn)通過優(yōu)化色譜和質(zhì)譜條件建立了測定氨茶堿制劑含量的UFLC-MS/MS法，該方法縮短了分析時(shí)間，大大提高了分析工作效率，尤其可能適用于微量樣品的分析，比如可用于藥動(dòng)學(xué)的研究。

1 材料

UFLC儀（日本島津公司）；API 3200三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國AB公司）；高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；超聲波清洗器（奧特賽恩斯儀器有限公司）；渦旋混勻器（金壇市金城教學(xué)儀器廠）。

氨茶堿標(biāo)準(zhǔn)品（中國食品藥品檢定研究院，批號：0844-9802，純度：供含量測定用）；氨茶堿片（山西云鵬制藥有限公司，批號：B110101、A100302、A101002，規(guī)格：每片0.1 g）；氨茶堿注射液（上?，F(xiàn)代哈森藥業(yè)有限公司，批號：10091612，規(guī)格：2 ml∶0.25 g；山西晉新雙鶴藥業(yè)有限公司，批號：1005161，規(guī)格：2 ml∶0.25 g；常州蘭陵制藥有限公司，批號：1010202，規(guī)格：10 ml∶0.25 g；河南潤弘制藥股份有限公司，批號：1011231，規(guī)格：2 ml∶0.25 g）；乙腈、甲醇、甲酸均為色譜純，水為滅菌注射用水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜、質(zhì)譜條件的建立

色譜柱：Shim-pack XR-ODS（75 mm×3.0 mm，2.0 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.4%甲酸水溶液（54∶46，V/V），流速：0.40 ml/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μl；整個(gè)分析流程用時(shí)3 min。

質(zhì)譜采用電噴霧離子源（ESI）正離子多反應(yīng)（MRM）方式檢測；氨茶堿在ESI源正離子電離方式下，有較好的質(zhì)譜響應(yīng)，主要生成[M+H]+離子峰，為m/z181.0；噴霧電壓（IS）：4 500 V；霧化溫度（TEM）：450℃；氨茶堿檢測離子對m/z181.0→124.0；碰撞誘導(dǎo)解離電壓（DP）：35 psi；碰撞能量（CE）：25 psi。選擇性對[M+H]+離子進(jìn)行碎片質(zhì)譜分析得相應(yīng)的二級掃描質(zhì)譜圖，見圖1。

2.2 方法的專屬性

在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，分別取空白溶液（流動(dòng)相）、“2.3”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)品溶液與供試品溶液（片劑，批號：B110101）進(jìn)樣測定，得到特征峰。結(jié)果，氨茶堿保留時(shí)間附近未見雜質(zhì)峰，說明輔料對測定無干擾，詳見圖2。

圖1 氨茶堿掃描質(zhì)譜圖A.母離子；B.碎片離子Fig1 MS/MS spectra of aminophyllineA.parent ion；B.fragment ion

圖2 超快速液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜圖A.空白溶液；B.標(biāo)準(zhǔn)品溶液；C.供試品溶液；1.氨茶堿Fig 2UFLC-MS/MS chromatogramsA.blank solution；B.standard solution；C.test sample solution；1.aminophylline

2.3 溶液的制備

標(biāo)準(zhǔn)品溶液：精密稱取氨茶堿標(biāo)準(zhǔn)品0.002 0 g于10 ml量瓶中，加入滅菌注射用水溶解并定容，得質(zhì)量濃度為200 μg/ml氨茶堿標(biāo)準(zhǔn)溶液作為貯備液；將貯備液依次用流動(dòng)相稀釋成質(zhì)量濃度為0.25、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 ng/ml的系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

供試品溶液：取氨茶堿片20片，精密稱定，研細(xì)。精密稱取適量（約相當(dāng)于氨茶堿50 mg），置于200 ml量瓶中，加0.1 mol/L氫氧化鈉溶液10 ml與水30 ml，振搖10 min使氨茶堿溶解，用水稀釋至刻度，搖勻，濾過。精密吸取續(xù)濾液20 μl，置于100 ml量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得。

精密量取氨茶堿注射液適量，用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液定量稀釋制成每1 ml中約含氨茶堿100 μg的溶液。精密吸取溶液50 μl，置于100 ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

供試品溶液進(jìn)樣前于10 000 r/min離心3 min，吸取上清液于進(jìn)樣瓶中待測。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

取“2.3”項(xiàng)下氨茶堿系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)樣分析，以質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得方程Y＝353X+1.1×103（r＝0.999 8），權(quán)重：1/x2。結(jié)果表明，氨茶堿檢測質(zhì)量濃度線性范圍為0.25～100 ng/ml，最低定量限為0.25 ng/ml。

2.5 精密度試驗(yàn)

取一定量的氨茶堿標(biāo)準(zhǔn)品貯備液用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為0.3、50、85 ng/ml的質(zhì)量控制（QC）樣品各5份，進(jìn)樣分析，計(jì)算得日內(nèi)RSD分別為2.45%、1.85%、0.90%；取上述濃度的QC樣品連續(xù)測定3 d，得日間RSD分別為2.84%、1.91%、1.13%。RSD均≤2.84%，符合制劑分析的方法學(xué)要求。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批氨茶堿片5份，按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備5份供試品溶液，進(jìn)樣分析，結(jié)果含量的RSD＝1.11%，表明本方法有較好的重復(fù)性。

2.7 回收率試驗(yàn)

取已知含量的氨茶堿供試品溶液（片劑，批號：B110101）0.5 ml共5份，分別加入100 ng/ml的氨茶堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液10、25、50、100、200、500 μl，渦旋混勻后進(jìn)樣分析，計(jì)算回收率。結(jié)果氨茶堿回收率分別為99.10%、99.50%、99.29%、100.29%、99.66%、100.64%，平均值為99.75%，符合要求。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份供試品溶液，分別于制備后0、6、24 h后依法測定，結(jié)果，峰面積的RSD＝1.67%，表明供試品溶液于室溫下放置24 h穩(wěn)定。

2.9 2種氨茶堿制劑含量測定結(jié)果

按“2.3”項(xiàng)下方法制備不同批號氨茶堿供試品溶液，進(jìn)樣分析。結(jié)果不同廠家的藥品含量測定結(jié)果均符合《中國藥典》要求，但不同劑型的氨茶堿含量有一定差異，詳見表1。

表1 7批氨茶堿制劑含量測定結(jié)果（n＝3）Tab1 Content determination of aminophylline in 7 batches ofAminophylline preparation（n＝3）

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

本試驗(yàn)前期考察了流動(dòng)相中不同體積分?jǐn)?shù)（0.2%、0.3%、0.4%）的甲酸水溶液對氨茶堿檢測的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)甲酸體積分?jǐn)?shù)為0.4%時(shí)，氨茶堿峰形、響應(yīng)值和分析時(shí)間均較好，所以選擇以乙腈-0.4%甲酸水溶液（54∶46，V/V）為流動(dòng)相，同時(shí)檢測限更低。

3.2 質(zhì)譜條件的選擇

選用1 μg/ml氨茶堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行質(zhì)譜條件的選擇，以ESI+作為電離模式，氨茶堿有較好的質(zhì)譜響應(yīng)，且分別對IS、DP、TEM、CE等質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，使得質(zhì)譜掃描達(dá)到最佳，以便檢測，最終確立了“2.1”項(xiàng)下的各項(xiàng)質(zhì)譜條件為最優(yōu)。

雖然已有報(bào)道采用HPLC法、UV法測定氨茶堿制劑含量的方法，但目前尚未見采用UFLC-MS/MS法測定氨茶堿制劑含量的文獻(xiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)方法具有簡單可靠、準(zhǔn)確靈敏、快速高效的優(yōu)點(diǎn)，并且重復(fù)性好，輔料未見干擾。

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同劑型的氨茶堿含量有一定差異，故建立氨茶堿質(zhì)量控制的UFLC-MS/MS方法具有重要意義，本方法氨茶堿定量限為0.25 ng/ml，適用于少量樣品及生物樣品的分析，與已有報(bào)道的HPLC法、UV法相比，本方法更加靈敏、準(zhǔn)確、專屬性好，減少了操作誤差，且取樣量少，適用于氨茶堿制劑的含量測定，同時(shí)也可能適用于血樣等生物樣品的分析。

[1]陳新謙，金有豫，湯光.新編藥物學(xué)[M].17版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2011：446.

[2]陳怡祿，鄧力，呂回，等.嬰兒氨茶堿急性中毒的臨床診斷治療及藥物代謝動(dòng)力學(xué)[J].中國臨床藥理學(xué)雜志，2002，18（2）：145.

[3]牟信兵，廖國云，高鈺琪，等.速尿和氨茶堿對小豬再缺氧損傷的預(yù)防效果[J].中華航空航天醫(yī)學(xué)雜志，2004，15（3）：137.

[4]黃躍生，劉志松，呂荷，等.高效液相色譜法測定復(fù)方茶堿片中主要成分的含量[J].藥物分析雜志，1992，12（1）：28.

[5]Yin C，Tang C，Wu X.HPLC determination of aminophylline，methoxyphenamine hydrochloride，noscapine and chlorphenamine maleate in compound dosage forms with an aqueous-organic mobile phase[J].J Pharm Biomed Anal，2003，33（1）：39.

[6]Chen G，Chu Q，Zhang L，et al.Separation of six purine bases by capillary electrophoresis with electrochemical detection[J].Analytica Chimica Acta，2002，457（2）：225.

[7]Mazurek S，Szostak R.Quantitative determination of diclofenac sodium and aminophylline in injection solutions by FT-Raman spectroscopy[J].J Pharm Biomed Anal，2006，40（5）：1 235.

[8]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：二部[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：836-837.