戚筠 楊楊

（武漢科技大學(xué)附屬天佑醫(yī)院內(nèi)分泌科，湖北武漢 430064）

目前研究認(rèn)為，2型糖尿?。╰ype 2diabetes mellitus，T2DM）的發(fā)生和發(fā)展是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，其中氧化應(yīng)激是T2DM發(fā)病的核心因素。熱休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）在應(yīng)激狀態(tài)下高度表達(dá)，它可參與免疫反應(yīng)，具有抗細(xì)胞凋亡、抗氧化功能，而且可以提高細(xì)胞的應(yīng)激耐受性，故可保護胰島β細(xì)胞在應(yīng)激狀態(tài)時免遭損害。本研究旨在通過對T2DM患者外周血漿中HSP70抗體水平的檢測，進一步了解HSP70及其抗體與T2DM的關(guān)系。

1 資料與方法

1．1 一般資料 2009年1月—2010年12月在我院確診為T2DM的112例患者為T2DM組，年齡35～65歲，平均年齡（54．15±11．81）歲；男性65例，女性57例。選取同時間段在我院體檢的110例健康人為對照組，年齡32～62歲，平均年齡（52．93±11．24）歲；男性70例，女性40例。

1．2 血漿HSP70抗體滴度的檢測 采用蛋白質(zhì)免疫印跡－酶聯(lián)免疫吸附法（Western blot－ELISA），基本步驟如下：將細(xì)菌表達(dá)的重組人類HSP70抗原經(jīng)10%十二烷基磺酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠（SDSPAGE）電泳分離，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素（nitrocellulose filter membrane，NC）膜；切下含 HSP70抗原的NC膜條并裁成2mm×2mm的膜片，分裝入96孔酶標(biāo)板，每孔加入200μL磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗30min，吸去PBS后加入5%脫脂奶粉于37℃飽和封閉1h；按1∶10、1∶20、1∶40、1∶80稀釋待檢血漿，各加入200μL稀釋液于酶標(biāo)孔中，記錄加樣順序。4℃孵育過夜，棄去稀釋血漿，加入200μL Tris緩沖液（TBS）洗滌10min，重復(fù)6次。每孔加入200μL 1∶500稀釋的辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗人IgG，37℃孵育育2h。200μL TBS洗滌10min，重復(fù)8次。100μL DAB顯色液顯色5～10min，37℃溫育可加快顯色速度。

結(jié)果判斷：終止顯色，陽性結(jié)果為NC膜一面的中間有一條肉眼可見的棕色條帶，另一面則沒有或極弱。陰性則無棕色條帶。

1．3 統(tǒng)計學(xué)處理 對兩組患者的年齡進行非配對t檢驗，采用χ2檢驗分析性別構(gòu)成比、HSP70抗體陽性率，采用非條件Logistic回歸分析HSP70抗體與T2DM的關(guān)系。P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 T2DM組與對照組HSP 70抗體的檢測結(jié)果T2DM組與對照組HSP70抗體陽性例數(shù)分別為36例和9例，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05），不同滴度HSP70抗體的陽性例數(shù)在兩組之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）。見表1。

表1 兩組HSP70抗體的檢測結(jié)果n（%）

2．2 HSP70抗體與T2DM的關(guān)系 針對HSP70抗體與T2DM關(guān)系的非條件多元Logistic回歸分析結(jié)果見表2。

表2 T2DM危險因素的非條件Logistic回歸分析

3 討 論

熱休克蛋白（heat shock proteins，HSPs）是一組在進化上高度保守的蛋白質(zhì)，按其分子量大小可分為 HSP90－100、HSP70、HSP60、小分子 HSP及泛素等幾個家族。其中HSP 70家族因具有廣泛的生物學(xué)功能而成為當(dāng)今生命科學(xué)研究中的熱點［1］。

HSP的“分子伴侶”功能己被人們所了解，它通過與多種具有不同功能的蛋白質(zhì)在細(xì)胞中形成復(fù)合體而參與有關(guān)蛋白的折疊、亞基的組成、細(xì)胞內(nèi)運輸及蛋白質(zhì)降解等過程，保護細(xì)胞免受損傷和其它應(yīng)激的影響［2］。HSP70亦參與炎性反應(yīng)與免疫應(yīng)答。一旦機體由于化學(xué)和物理因素的刺激導(dǎo)致HSP的高表達(dá)，T細(xì)胞免疫和體液免疫就被激活，產(chǎn)生HSP70抗體，誘發(fā)針對機體的炎性反應(yīng)和免疫反應(yīng)［3］。目前許多研究［4］提示，HSP抗體與疾病的發(fā)生、治療或預(yù)后有關(guān)。鄔堂春等［5］發(fā)現(xiàn)，血漿中HSP70抗體的出現(xiàn)與多種疾?。ㄈ缰惺睢⒈街卸?、高血壓、免疫性疾病等）有關(guān)。但是關(guān)于抗人HSP抗體在T2DM患者中是否存在，以及其與T2DM發(fā)病的關(guān)系，目前研究尚少見。

本研究結(jié)果顯示，112例T2DM患者中抗HSP70抗體陽性36例，110例對照組中抗體陽性9例，兩組抗體陽性率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）。Logistic回歸分析顯示，抗HSP70抗體是T2DM的獨立危險因素。

本研究結(jié)果提示，HSP70抗體與T2DM發(fā)病相關(guān)，但是關(guān)于HSP70抗體如何影響T2DM發(fā)病原因尚不明確，有待進一步研究。

［1］ Weng D，Calderwood SK，Gong J．Preparation of a heat－shock protein 70－based vaccine from DC－tumor fusion cells ［J］．Methods Mol Biol，2011，787：255－265．

［2］ Gobbo J，Gaucher－Di－Stasio C，Weidmann S，et al．Quantification of HSP27and HSP70molecular chaperone activities［J］．Methods Mol Biol，2011，787：137－143．

［3］ Borges TJ，Wieten L，van Herwijnen MJ，et al．The anti－inflammatory mechanisms of Hsp70［J］．Front Immunol，2012，3：95．

［4］ Wu T，Chen S，Xiao C，et al．Presence of antibody against the inducible Hsp71in patients with acute heat－induced illness［J］．Cell Stress Chaperones，2001，6（2）：113－120．

［5］ 鄔堂春，賀涵貞，張國高．熱應(yīng)激蛋白研究的進展與前景［J］．中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2000，34（1）：6－7．