王 艷，劉昌華，章建浩*，靳國鋒

(國家肉品質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心，教育部肉品加工與質(zhì)量控制重點實驗室，農(nóng)業(yè)部農(nóng)畜產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制重點開放實驗室，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095)

傳統(tǒng)臘肉和西式培根隨工藝時間的延長和后期高溫成熟形成其特殊濃郁風(fēng)味，深受消費者的喜愛。脂肪分解氧化是培根和臘肉工藝過程中極易發(fā)生的重要生化反應(yīng)過程，對感官風(fēng)味和品質(zhì)質(zhì)量產(chǎn)生重要影響，受工藝過程中溫度、濕度條件和產(chǎn)品中鹽分、水分、pH值等的影響，其中溫度因子尤其重要。風(fēng)干成熟工藝使肌肉中脂質(zhì)在脂肪酶作用下分解，游離脂肪酸(FFA)大量增加，為培根風(fēng)味形成提供了物質(zhì)基礎(chǔ)；后隨溫度升高游離脂肪酸分解速率大于生成速率，脂質(zhì)氧化生成醛、酮等小分子化合物，積累風(fēng)味化合物，但是脂質(zhì)過度氧化又會對風(fēng)味有不良影響，使產(chǎn)品產(chǎn)生酸敗味。由于肉制品中脂質(zhì)分解氧化對產(chǎn)品品質(zhì)質(zhì)量影響的兩面性，國際與國內(nèi)近幾年對工藝過程脂質(zhì)分解氧化機理進行了系統(tǒng)深入的研究。國外有學(xué)者[1]通過測定脂肪組成、游離脂肪酸、脂質(zhì)氧化指標、特征風(fēng)味物質(zhì)變化研究了干腌火腿加工工藝過程中皮下脂肪分解氧化的影響，發(fā)現(xiàn)風(fēng)干前期脂質(zhì)就開始發(fā)生強烈的脂肪水解，亞油酸含量不斷降低，脂質(zhì)分解能夠促進脂肪氧化。Yang Hongju等[2]研究了宣威火腿加工過程中甘油酯、磷脂和脂肪酸中游離脂肪酸的變化規(guī)律。Toldra[3]研究了不同水分活度條件下脂肪水解酶活力的變化情況，發(fā)現(xiàn)不斷增加的酶活力與風(fēng)味物質(zhì)發(fā)展相一致。Muriel等[4]描述了利比亞干腌豬五花肉脂質(zhì)分解產(chǎn)物游離脂肪酸與脂質(zhì)氧化指標硫代巴比妥酸值、己醛和腐敗味的相關(guān)性。Zhang Jianhao等[5-6]在研究金華火腿傳統(tǒng)工藝過程中脂質(zhì)分解氧化與風(fēng)味形成變化規(guī)律基礎(chǔ)上，通過研制風(fēng)干發(fā)酵成熟現(xiàn)代工藝裝備，對金華火腿采用強化高溫成熟加快脂質(zhì)分解氧化與風(fēng)味形成，縮短工藝時間并降低氧化指標進行了有效探索。Jin Guofeng等[7]通過探究干腌培根溫度這一工藝參數(shù)，從調(diào)控脂肪氧合酶活性的角度研究加速脂質(zhì)分解氧化，促進風(fēng)味形成，同時降低氧化指標的措施。

不同于以往研究采用長時間提高風(fēng)干成熟溫度的強化高溫工藝，本實驗在風(fēng)干成熟前期就進行短時強化高溫風(fēng)干(65℃、0.5h)，通過激活與脂質(zhì)分解氧化相關(guān)的酶活力，使酶活性維持在一個較高的水平，加速脂質(zhì)分解氧化，促進風(fēng)味物質(zhì)形成，同時降低脂質(zhì)氧化指標，以達到提高其品質(zhì)風(fēng)味的目的。通過比較中式培根強化高溫組和對照組加工工藝過程中脂肪水解酶活力、游離脂肪酸變化和脂肪氧合酶活力、硫代巴比妥酸值、過氧化值情況，以及它們之間的相關(guān)性，旨在探索其風(fēng)干成熟過程中脂肪分解氧化規(guī)律，為中式培根現(xiàn)代新工藝應(yīng)用推廣提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

豬五花肉購于南京衛(wèi)崗蘇果超市。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3CW型pH復(fù)合電極 上海理達儀器廠；SPX-250型恒溫恒濕箱 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器有限公司；DC-12H型氮吹儀 上海安譜科學(xué)儀器有限公司；TRACE GC Ultra氣相色譜儀(配AS3000自動進樣器和Xcalibur色譜工作站) 美國Thermo Fisher公司；IKAT18basic型高速分散機 德國IKA公司；Allegra 64R型高速冷凍離心機 美國Beckman Coulter公司；722型可見光光度計 上海精密科學(xué)儀器有限公司；Spectra Max M2e酶標儀 美國Molecular Devices公司；UV-2450型紫外分光光度計 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 培根制作

新鮮豬五花肉→整形→腌制→強化高溫風(fēng)干→風(fēng)干成熟→成品

將豬五花肉分割成均勻的18塊，每塊平均質(zhì)量約500g。按用鹽量占肉的質(zhì)量分數(shù)為1.8%的量干腌肉塊，將鹽均勻涂抹于肉塊表面，然后將其放于4℃的冰箱里腌制3d。腌制結(jié)束，移入恒濕恒溫箱風(fēng)干成熟，先在溫度65℃、相對濕度74%的條件下高溫風(fēng)干0.5h，然后在起始溫度18℃、相對濕度72%的控溫控濕條件下(期間每天升溫1.5℃，濕度下降0.5%)風(fēng)干成熟8d后即得成品。其中強化高溫組為經(jīng)65℃強化高溫0.5h制作的中式培根的實驗組；對照組為未進行風(fēng)干前期強化高溫處理，同實驗組其他工藝制作條件完全相同的中式培根組。

1.3.2 取樣和抽樣工藝點

抽樣工藝點：在原料、腌制結(jié)束、強化高溫結(jié)束、風(fēng)干3d、風(fēng)干6d、風(fēng)干8d共6大工藝點抽樣，如表1所示。取各處理組工藝點樣品，剔除筋腱、脂肪，留肌肉層作為材料，真空包裝，―20℃條件下貯存?zhèn)溆谩?/p>

表1 中式培根腌制高溫風(fēng)干強化成熟工藝參數(shù)Table 1 Parameters for intensified high-temperature drying-ripening of Chinese bacon

1.3.3 指標測定

1.3.3.1 總脂質(zhì)提取

參照Folch等[8]的方法， 45℃條件下用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀提純得到油脂純品。

1.3.3.2 脂質(zhì)分離

根據(jù)García Regueiro等[9]方法進行。

1.3.3.3 脂肪酶提取及活力測定

酶液提取利用Henándz等[10]的方法；利用考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量，分析酶活力。中性脂肪酶活力測定參照Vestergaard等[11]方法。酸性脂肪酶活力測定同樣參照Vestergaard等[11]的方法。磷脂酶活力測定利用Motilva等[12]的方法。

以上所有測定均重復(fù)3次，酶活力采用標準曲線法進行，分別用以上3種酶測定所用緩沖液配制系列濃度的4-甲基形酮溶液作標準曲線。酶活力單位(U)定義為：1g酶蛋白在1h內(nèi)產(chǎn)生1nmol的4-甲基形酮為1個酶活力單位。

1.3.3.4 脂肪氧合酶提取及活力的測定

脂肪氧合酶的提取、亞油酸底物制備及酶活力測定參照Gata等[13]的方法。

1.3.3.5 脂質(zhì)氧化指標測定

TBARs值測定按照Salih等[14]的方法。POV測定按GB/T 5009.37—2003《食用植物油衛(wèi)生標準的分析方法》。

1.3.3.6 游離脂肪酸測定及氣相色譜(GC)分析

游離脂肪酸甲酯化：向脂質(zhì)提取分離后的游離脂肪酸中加入2mL質(zhì)量分數(shù)10%三氟化硼-甲醇，加少量2,2-二甲氧基丙烷作為除水劑(吸收甲酯化產(chǎn)生的微量水)，60℃水浴30min，使FFA甲酯化。冷卻，加1mL蒸餾水和1mL正庚烷振蕩，靜置分層后完全吸取上層有機層，加入十七酸甲酯作為內(nèi)標，用氮吹儀揮干溶劑，用正庚烷定容，以備色譜測定。

氣相色譜(G C)分析：各種游離脂肪酸甲酯采用氣相色譜儀分析，色譜柱：D B-2 3 F A M E 柱子(60m×0.25mm，0.25μm)；升溫程序：初溫90℃，保持2min，以10℃/min升到180℃，保持5min，再以5℃/min升到240℃，保持12min；載氣(高純氮)流速為1mL/s；進樣量：1μL，分流比1：70；進樣口溫度240℃；火焰離子監(jiān)測器(FID)檢測溫度240℃。

標準曲線的制作：參考章建浩等[6]方法，稍作修改。以十七酸甲酯作內(nèi)標物進行GC分析測定，以各標樣脂肪酸甲酯與內(nèi)標峰面積的比值為縱坐標，標樣梯度為橫坐標，建立游離脂肪酸標準曲線方程。將GC測定樣品的脂肪酸甲酯峰面積與內(nèi)標十七酸甲酯峰面積比值代入標準曲線方程，即可計算各種FFA的濃度。

1.4 統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)用Microsoft Excel進行整理，用SAS 8.2統(tǒng)計軟件進行方差分析(ANOVA)，不同平均值之間利用Fisher’s最小顯著差異法(LSD)進行差異顯著性檢驗，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 加工過程中脂肪酶活力的變化

圖 1 中式培根加工過程中中性酯酶(A)、酸性酯酶(B)和磷脂酶活力(C)的變化Fig.1 Changes in neutral lipase (A), acid lipase (B) and phospholipase (C) activities during processing

中性脂肪酶是中式培根加工過程中主要的脂肪分解酶，由圖1可知，其酶活力始終高于酸性酯酶和磷脂酶的活力。不論強化高溫組還是對照組3種脂肪水解酶活力在整個加工過程中基本都呈持續(xù)下降趨勢，但相對于對照組，強化高溫組脂肪酶活力在強化高溫結(jié)束均發(fā)生顯著增強(P＜0.05)，中性酯酶、酸性酯酶和磷脂酶活力分別增加了30.65%、63.64%和87.10%。在之后風(fēng)干階段酶活力始終高于對照組，說明強化高溫處理可以激活脂肪水解酶活力，使酶活力保持較高的水平。這可能是因為65℃強化高溫處理，實際上肉塊內(nèi)部溫度只達到45℃左右，接近脂肪酶的最適溫度，導(dǎo)致更多的底物與酶發(fā)生反應(yīng)，使脂肪酶表現(xiàn)較高的催化活性，在加工前期脂質(zhì)就發(fā)生較大程度地分解。

到成熟結(jié)束，中性脂酶、酸性脂酶、磷脂酶的活力分別下降了69.5%、75.4%和69.2%，除酸性酯酶外，其他2種酶活都高于對照組。此結(jié)論與Zhou等[15]的研究結(jié)果類似，加工過程中金華火腿肌肉中3種酶活力都顯著下降，且中性脂酶活力也是保持最高水平。但與本研究結(jié)論不同，Jin Guofeng等[16]研究發(fā)現(xiàn)干腌培根在加工過程中酸性脂酶的活力始終高于其他2種酶活力，這可能與原料、加工工藝的不同有關(guān)。

2.2 加工過程中式培根肌肉中游離脂肪酸的變化

表2 中式培根強化高溫工藝過程肌肉中游離脂肪酸含量的變化 Table 2 Changes in muscle free fatty acid contents of Chinese bacon during processing mg/g

由表2可知，飽和脂肪酸(SFA)、單不飽和脂肪酸(MUFA)和多不飽和脂肪酸(PUFA)含量在風(fēng)干過程中有顯著變化(P＜0.05)。SFA在風(fēng)干6d后達到最大值，而MUFA在風(fēng)干3d就達到最大值，之后呈顯著降低(P＜0.05)的變化趨勢，但到成品時仍然高于原料中的含量。SFA上升趨勢顯著(P＜0.05)，增加最多，風(fēng)干8d時與原料相比增加了5.52mg/g脂質(zhì)，其中棕櫚酸(C16：0)和硬脂酸(C18：0)變化最大；MUFA稍有增加，差異不顯著；PUFA呈先增加后減少的變化趨勢，在強化高溫結(jié)束時就達到最大7.17mg/g脂質(zhì)，然后顯著降低，到成熟結(jié)束時含量不到強化高溫時的一半，其中亞油酸(C18：2)減少最多。

游離脂肪酸的變化是一個動態(tài)平衡的過程，一方面脂肪分解生成FFA，另一方面FFA氧化分解。與傅櫻花[17]研究的臘肉加工過程中主要FFA種類一致，中式培根中棕櫚酸(C16：0)、硬脂酸(C18：0)、油酸(C18：1)、亞油酸(C18：2)是FFA的主體成分，始終占FFA含量的大部分，在原料中占78.49%，到風(fēng)干成熟結(jié)束時占81.62%。由圖2可知，4種脂肪酸含量在工藝過程中均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。原料中4種FFA含量有明顯差異，與對照組相比，經(jīng)強化高溫處理FFA含量有顯著增加(P＜0.05)。不飽和程度越高，F(xiàn)FA越快達到最大值。飽和脂肪酸棕櫚酸和硬脂酸在風(fēng)干成熟6d后達到最大值；油酸含量在風(fēng)干3d結(jié)束時達到最大值，亞油酸含量在強化高溫結(jié)束時就處于最高水平，比對照組增幅達41.73%，差異極顯著(P＜0.01)。同時不飽和程度越高，F(xiàn)FA含量下降的幅度越大，到加工后期隨加工溫度的升高，飽和脂肪酸棕櫚酸和硬脂酸含量略有下降，但到加工結(jié)束時強化高溫組和對照組成品的FFA趨于一致；不飽和脂肪酸油酸、亞油酸比飽和脂肪酸更易氧化，從風(fēng)干中期開始就急速減少，到成熟結(jié)束時成品中含量比對照組降低了32.84%(P＜0.05)。

圖 2 中式培根加工過程中主要游離脂肪酸含量的變化Fig.2 Changes in major FFA in Chinese bacon during processing

2.3 加工過程中脂肪氧化的變化

由圖3可知，強化高溫風(fēng)干成熟工藝對加工過程中POV和TBARs值都有較顯著影響(P＜0.05)。無論是強化高溫組還是對照組，脂質(zhì)氧化指標在整個工藝過程中的變化趨勢是一致的，都是先升高后降低的趨勢。在低溫腌制階段POV顯著增大，在強化高溫組風(fēng)干成熟加工工藝中最高值出現(xiàn)在強化高溫階段，而對照組風(fēng)干成熟工藝中最高值出現(xiàn)在之后的風(fēng)干成熟3d結(jié)束時，最高POV分別為0.131、0.123g/100g脂肪，說明在風(fēng)干初期已經(jīng)發(fā)生脂質(zhì)氧化，強化高溫可以加速脂質(zhì)氧化速率。之后POV顯著下降(P＜0.05)，且風(fēng)干階段強化高溫組始終低于對照組，風(fēng)干結(jié)束后強化高溫組最終產(chǎn)品POV為0.022g/100g，比對照組降幅達45.00%，表明強化高溫風(fēng)干工藝可以有效降低產(chǎn)品POV。

圖 3 TBARs值(A)和POV(B)在中式培根加工過程中的變化趨勢Fig.3 Changes in TBARs (A) and POV (B) in Chinese bacon during processing

與POV的變化趨勢相似，TBARs值也呈現(xiàn)先上升后降低的過程。這與傅櫻花[17]研究的中國傳統(tǒng)臘肉加工過程中TBARs的變化趨勢相一致。強化高溫組TBARs最大值比對照組提前出現(xiàn)，表明強化高溫處理加快了脂質(zhì)氧化速率，揮發(fā)性風(fēng)味化合物快速積累。進入風(fēng)干階段TBARs又都顯著下降(P＜0.05)，風(fēng)干階段強化高溫組始終低于對照組。強化高溫風(fēng)干成熟工藝中式培根最終產(chǎn)品的TBARs值為0.17mg/kg肌肉，降幅達26.10%，低于張楊萍等[18]研究的干腌培根。

2.4 加工過程中脂肪氧合酶(LOX)活力的變化

圖 4 風(fēng)干成熟工藝過程中式培根肌肉脂肪氧合酶活力的變化Fig.4 Changes in muscle lipoxygenase activity of Chinese bacon during processing

由圖4可知，LOX活力在腌制階段顯著上升(P＜0.05)，腌制結(jié)束后隨著風(fēng)干成熟過程的進行，對照組LOX活力逐漸下降，到風(fēng)干成熟8d結(jié)束，LOX活力達到最低為(9.00±0.59)U/(min·g)，略高于原料中酶活力。在腌制階段LOX活力顯著增加可能是由于LOX是一種非血紅素鐵蛋白，鹽后的POV和TBARs都顯著提高，此時鐵離子發(fā)生轉(zhuǎn)變，酶被激活；之后隨著生產(chǎn)過程的進行，酶活力又不斷下降是由于細胞組織中的蛋白酶釋放和鹽的濃縮效應(yīng)使LOX受到了破壞。與對照組相比，實驗組經(jīng)過強化高溫后，LOX活力顯著升高達(51.02±0.72)U/(min·g)，是原料階段酶活力的5倍以上，與對照組相比LOX活力增幅為73.42%(P＜0.05)，并且之后的風(fēng)干成熟階段活力均高于對照組。說明溫度是影響LOX活力的重要因子，65℃的強化高溫可以激活酶的活力，使催化活力效能最優(yōu)化，導(dǎo)致溫度對LOX活力的促進作用大于鹽分對其的抑制作用，有利于LOX催化脂質(zhì)氧化。

2.5 強化高溫風(fēng)干成熟工藝過程中式培根各指標的相關(guān)性

表3 中式培根強化高溫工藝過程中肌肉各指標之間的Pearson相關(guān)系數(shù)Table 3 Pearson’s correlation coefficients among vairous muscle parameters of Chinese bacon subjected to intensifed high-temperature drying-ripening

由表3可知，酸性脂肪酶活力與∑PUFA的相關(guān)性要大于中性脂肪酶和磷脂酶與∑PUFA的相關(guān)性，表明酸性脂肪酶是催化脂肪分解為FFA，特別是PUFA的重要脂肪酶。這可能與中式培根加工過程中肌肉的pH值始終保持酸性脂肪酶作用的最適酸性范圍有關(guān)(pH5.4～6.4)。脂質(zhì)氧化指標TBARs值、POV和脂肪氧合酶活力之間呈極顯著(P＜0.01)正相關(guān)。亞油酸含量與∑PUFA呈極顯著(P＜0.01)正相關(guān)，說明亞油酸是中式培根中最主要的多不飽和脂肪酸。以亞油酸為代表的多不飽和脂肪酸含量與脂質(zhì)氧化指標TBARs值、POV和脂肪氧合酶活力之間呈極顯著(P＜0.01)正相關(guān)，一方面說明亞油酸容易被氧化，脂質(zhì)氧化程度與其含量有重要關(guān)系，亞油酸含量越高，脂質(zhì)氧化程度越強；另一方面說明培根肌肉中LOX主要以亞油酸為底物；再者表明脂質(zhì)分解與脂質(zhì)氧化之間有一定的相關(guān)性，脂質(zhì)分解可以促進脂質(zhì)氧化。

3 討論與結(jié)論

強化高溫風(fēng)干成熟工藝即通過在風(fēng)干前期短時高溫強化中式培根，可以激活脂肪水解酶和脂肪氧合酶的活力來達到調(diào)控脂質(zhì)分解氧化的目的。據(jù)相關(guān)報道[19-20]，對干腌肉制品進行強化高溫處理，不僅可以顯著提高FFA含量，有利于小分子風(fēng)味物質(zhì)積累，而且能夠縮短工藝時間，降低氧化指標。本研究強化65℃、0.5h高溫條件與報道的長時間梯度升溫不一樣，但得到的結(jié)果基本一致。經(jīng)強化高溫處理3種脂肪水解酶活力均提高，且在后續(xù)風(fēng)干階段也保持較高水平，催化脂質(zhì)快速分解，使產(chǎn)物FFA增加量維持在較高水平，脂質(zhì)氧化反應(yīng)底物有較快增加。FFA不飽和程度越高，其含量增加的速度越快。以亞油酸為代表的多不飽和脂肪酸含量顯著增加(P＜0.05)，在強化高溫結(jié)束時就達到最大值。由相關(guān)性分析，表明脂質(zhì)分解可以促進脂質(zhì)氧化。Coutron-Gambotti等[1]研究也發(fā)現(xiàn)干腌火腿皮下脂肪強烈的脂肪水解能促進脂肪氧化。這是由于FFA是脂質(zhì)分解和氧化的樞紐性化合物；隨加工時間延長，溫度逐漸升高，脂質(zhì)氧化加快，使脂質(zhì)氧化的速率大于分解速率，F(xiàn)FA分解速率大于生成速率?！芐FA、∑MUFA和∑PUFA含量風(fēng)干階段后期都發(fā)生不同程度的減小，F(xiàn)FA不飽和程度越高，下降的幅度越大，越容易被氧化，特別是MUFA的油酸和PUFA的亞油酸下降顯著(P＜0.05)。在脂質(zhì)氧化方面，由于強化高溫處理使肉塊內(nèi)部溫度快速達到45℃左右，接近LOX最適溫度，激活了LOX活力，與對照組相比，增幅達73.4%，從而有利于催化FFA進一步氧化，加快脂質(zhì)一級氧化產(chǎn)物——氫過氧化物的形成，使POV最大值達到的時間提前。一方面由于中式培根中脂質(zhì)一級氧化所需的活化能(Ea)大于二級氧化所需的Ea，強化高溫加速脂質(zhì)一級氧化的同時，更容易加快脂質(zhì)二級氧化的發(fā)生，也使TBARs最大值達到的時間也提前[21]；另一方面風(fēng)干前期強化高溫處理可促進脂肪氧合酶活力，加速風(fēng)味前提物質(zhì)氫過氧化物的形成，而到工藝后期鹽含量快速升高酶活性被抑制，但不斷升高的溫度又會加快氫過氧化物分解，這樣不但降低了最終產(chǎn)品的脂質(zhì)氧化指標POV和TBARs值，保證產(chǎn)品更安全可靠；而且使得有更多時間用于醛、醇、酮、羧酸等風(fēng)味化合物的積累，提高產(chǎn)品的風(fēng)味品質(zhì)。

采用強化高溫現(xiàn)代工藝能夠顯著激活脂肪水解酶和脂肪氧合酶活力，使其催化活性在相當(dāng)長的時間內(nèi)處于高水平，加速中式培根肌肉脂質(zhì)分解FFA生成，特別是不飽和脂肪酸增加量顯著提高，促進脂質(zhì)進一步氧化使其留有更多的時間用于小分子風(fēng)味化合物的生成，有利于風(fēng)味積累和感官品質(zhì)改善，同時有效降低最終產(chǎn)品的POV和TBARs值，提高產(chǎn)品的安全性。因此，強化高溫風(fēng)干成熟新工藝調(diào)控脂質(zhì)分解氧化速率，改善腌臘肉制品風(fēng)味品質(zhì)是可行的。

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