范嘉龍，馬麗蘋，葉 紅，曾曉雄，孫 怡,*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471003)

苦丁茶冬青(Ilex kudincha C.J. Tseng)是冬青科冬青屬喬木植物，由其葉片加工而成的苦丁茶是我國南部和東部地區(qū)人民飲用的一種代用茶，苦丁茶也是傳統(tǒng)中成藥“甘和茶”的主要原料之一?？喽〔韪缓萍捌湓碥疹悺⒍喾?、氨基酸等活性物質(zhì)，具有抗氧化、降脂、抗炎殺菌、減肥、降血壓等多種藥理功能[1-3]。

與茶葉多糖的研究相比[4-5]，有關(guān)苦丁冬青苦丁茶多糖(Ilex kudincha C.J. Tseng polysaccharides，IKPS)的研究報(bào)道較少。吳曉鵬等[6-7]采用單因素和正交試驗(yàn)對苦丁冬青苦丁茶多糖提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，并研究發(fā)現(xiàn)苦丁冬青苦丁茶多糖對羥自由基、超氧陰離子自由基、DPPH自由基具有一定的清除作用，對H2O2誘導(dǎo)的紅細(xì)胞氧化溶血反應(yīng)和紅細(xì)胞自氧化溶血反應(yīng)都有顯著的抑制作用。何玲玲等[8-9]采用95%乙醇脫脂、水提取及80%乙醇沉淀的方法，從苦丁茶冬青葉中分離得到苦丁冬青苦丁茶粗多糖，經(jīng)過特征化學(xué)反應(yīng)及紫外光譜、紅外光譜分析，確定了提取物為多糖類化合物，且含有一定量的蛋白質(zhì)。最近，Sun等[10]對苦丁冬青苦丁茶多糖的提取、純化、體外抗氧化活性等進(jìn)行了初步研究，結(jié)果表明粗多糖及其純化組分對超氧陰離子自由基、羥自由基、DPPH自由基具有一定的清除作用和螯合金屬離子的能力。王新等[11-13]采用氣相色譜法(GC)分析了苦丁冬青苦丁茶多糖的單糖組成，結(jié)果表明多糖組分主要由阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖組成。GC法雖然可以準(zhǔn)確分析多糖組分中各種中性單糖，但是糖醛酸需要經(jīng)過還原與衍生化，才能用GC法測定。由于植物性多糖一般含有糖醛酸，因此我們在前期研究的基礎(chǔ)上利用高效液相色譜法(HPLC)與GC法分析IKPS的單糖組成，以期為IKPS的活性及其構(gòu)效關(guān)系的闡明提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料與試劑

苦丁冬青苦丁茶由海南椰仙生物科技有限公司提供。

l-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、巖藻糖、木糖、果糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、肌醇 美國Sigma 公司；乙腈(色譜純) 漢邦公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1100高效液相色譜儀(包括四元泵、示差折光檢測器(RID)、柱溫箱和化學(xué)工作站)、Agilent 6890氣相色譜儀 美國Agilent公司；BL-220H分析天平 日本Shimadzu公司；Heidolph Laborota 4000真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國Heidolph公司；真空冷凍干燥機(jī) 美國Labconco公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇國華電器有限公司；722S可見分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司；HL-2B 數(shù)顯恒流泵、BS-100A 自動部份收集器 上海滬西分析儀器廠；Anke TDL-5低速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 苦丁冬青苦丁茶粗多糖的制備

IKPS的制備參照趙天湖等[14]的方法進(jìn)行。將苦丁冬青苦丁茶磨碎，過80目篩，稱取粉碎茶樣200g，用15倍體積的85%乙醇、80℃回流提取3次，每次1h；5000r/min離心15min，殘?jiān)?0倍體積的去離子水進(jìn)行熱提取3次，水浴溫度90℃，每次提取時(shí)間3h。提取液離心、合并3次上清液，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀50℃減壓濃縮至初始體積的1/4，加入3倍濃縮液體積的無水乙醇，混勻，靜置12h，離心得沉淀。沉淀經(jīng)真空冷凍干燥，得到IKPS粗品。

1.2.2 苦丁冬青苦丁茶多糖的分離純化

稱取適量粗IKPS，去離子水溶解，上樣于DEAE Sepharose Fast Flow層析柱。依次用去離子水、0.1mol/L NaCl溶液、0.3mol/L NaCl溶液和0.5mol/L NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫，流速為2mL/min，自動收集器分部收集。硫酸苯酚法檢測洗脫液中總糖的含量，合并相同組分的收集液，50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，去離子水透析48h，以除去NaCl及小分子雜質(zhì)，然后將透析液真空冷凍干燥，得到純化組分IKPS-1、IKPS-2、IKPS-3和IKPS-4。

1.2.3 苦丁冬青苦丁茶多糖的單糖組成分析

1.2.3.1 GC法

參照Liu[15]、張惟杰[16]等報(bào)道的糖腈乙酸酯衍生物的GC法。

1.2.3.2 HPLC法

HPLC法參考戴軍等[17]的方法。1)多糖樣品的水解：取100L質(zhì)量濃度為1mg/mL的多糖樣品溶液，加入100L 4mol/L的三氟乙酸，充氮?dú)夥夤埽?10℃烘箱中水解2h，冷卻，加200L甲醇混勻并旋轉(zhuǎn)蒸干。2)PMP衍生化：于多糖的水解樣中加入50L 0.3mol/L 的NaOH溶液，充分溶解，加入50L 0.5mol/L的PMP甲醇溶液，混勻后在70℃的條件下反應(yīng)2h，冷卻，加入50L 0.3mol/L的HCl中和，蒸干；加入水和氯仿各1mL，混勻，靜置后棄去氯仿層，如此萃取3次，水相用0.45μm微孔膜過濾，供HPLC分析。8種標(biāo)準(zhǔn)單糖和2種糖醛酸的PMP衍生化方法同上。3)HPLC分析：色譜柱為Eclipse Plus C18(4.6mm ×250mm，5μm)；流動相為0.1mol/L磷酸鹽(pH 6.7)緩沖液：乙腈-水(83：17，V/V)，流速1.0mL/min；DAD檢測器，檢測波長245nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦丁冬青苦丁茶多糖的提取與純化

圖 1 苦丁冬青苦丁茶粗多糖經(jīng)DEAE Sepharose Fast Flow層析柱的梯度洗脫曲線Fig.1 Stepwise elution curve of crude IKPS on DEAE Sepharose Fast Flow anion-exchange chromatography column

采用熱水提取與醇沉制備得到IKPS粗品，并利用DEAE Sepharose Fast Flow柱層析對其進(jìn)行分離純化，結(jié)果如圖1所示。IKPS經(jīng)水和NaCl溶液梯度洗脫后分離得到4個(gè)洗脫峰，分別為IKPS-1、IKPS-2、IKPS-3和IKPS-4，分離效果好。分別收集各組分，50℃旋蒸濃縮，去離子水透析2～3d，經(jīng)真空冷凍干燥后得到IKPS-1、IKPS-2、IKPS-3和IKPS-4，其得率分別為2.40%、60.56%、30.42%和9.82%。

2.2 氣相色譜法分析苦丁冬青苦丁茶多糖單糖組成

圖 2 單糖(A)、IKPS粗品(B)及其純化產(chǎn)品IKPS-1(C)、IKPS-2(D)、IKPS-3(E)和IKPS-4(F)的氣相色譜圖Fig.2 Gas chromatograms of monosaccharide standards (A), crude IKPS (B), IKPS-1 (C), IKPS-2 (D), IKPS-3 (E) and IKPS-4 (F)

各標(biāo)準(zhǔn)單糖經(jīng)糖腈乙酸酯衍生化后，在檢測條件下測得的各標(biāo)樣氣相色譜如圖2A所示。與圖2A比較，從圖2B～F中可看出IKPS主要由鼠李糖、阿拉伯糖、巖藻糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖組成，各單糖的物質(zhì)的量百分比為12.84%、36.44%、10.12%、4.46%、4.12%和32.03%(表1)；IKPS-1主要由鼠李糖、阿拉伯糖、巖藻糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖組成，各單糖的物質(zhì)的量百分比分別為0.68%、33.14%、13.40%、7.57%、8.59%和36.62%；IKPS-2主要由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖組成，各單糖的物質(zhì)的量百分比分別為9.44%、13.44%、62.46%、6.35%和8.31%；IKPS-3主要由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖組成，各單糖的物質(zhì)的量百分比分別為7.48%、42.35%、10.60%、5.71%和33.85%；IKPS-4主要由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖組成，各單糖的物質(zhì)的量百分比分別為11.25%、13.81%、33.05%和41.88%。此法除半乳糖醛酸和果糖檢測不到外，其余7種單糖和葡萄糖醛酸均能被檢出，葡萄糖色譜峰稍小，其他單糖峰形對稱、獨(dú)立、易區(qū)分。

表1 苦丁冬青苦丁茶粗多糖及純化產(chǎn)品的單糖組成Table 1 Monosaccharide composition of crude IKPS and its purified fractions%

2.3 柱前PMP衍生高效液相色譜法分析苦丁冬青苦丁茶多糖單糖組成

IKPS經(jīng)過分離純化，被確認(rèn)為單一多糖后便可進(jìn)行單糖組成的分析。對多糖的單糖組成分析一般采用GC法，但由于單糖極性較強(qiáng)，結(jié)構(gòu)相近，且缺乏光學(xué)活性，不能測出糖醛酸，故為了改善其分離選擇性和提高檢測靈敏度，將多糖水解后采用柱前或柱后衍生化色譜法分離和檢測[18-21]。本實(shí)驗(yàn)在前人的基礎(chǔ)上針對苦丁冬青苦丁茶多糖的特性，采用PMP柱前衍生化法測定IKPS及其4個(gè)純化組分的單糖組成，結(jié)果表明PMP衍生化的合適條件為反應(yīng)時(shí)間120min和反應(yīng)溫度70℃。以0.1mol/L磷酸鹽緩沖液-乙腈為流動相，考察了衍生化時(shí)間和pH值對8種中性糖和2種糖醛酸的PMP衍生物的保留時(shí)間及分離效果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Eclipse Plus C18柱的分離效果好(圖3)，靈敏度高。

圖 3 單糖(A)、IKPS粗品(B)及其純化產(chǎn)品IKPS-1(C)、IKPS-2(D)、IKPS-3(E)和IKPS-4(F)的HPLC圖Fig.3 HPLC chromatograms of monosaccharides (A), crude IKPS (B), IKPS-1 (C), IKPS-2 (D), IKPS-3 (E) and IKPS-4 (F)

由圖3可知，IKPS主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、果糖、半乳糖、阿拉伯糖、巖藻糖組成，根據(jù)10種標(biāo)準(zhǔn)單糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線(表2)，計(jì)算得到各單糖的物質(zhì)的量百分比分別為6.98%、7.49%、3.64%、9.07%、6.35%、6.42%、21.22%、22.78%和7.03%(表1)；IKPS-1主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、果糖、半乳糖、阿拉伯糖、巖藻糖組成，各單糖的物質(zhì)的量百分比分別為5.02%、3.84%、2.46%、7.19%、4.14%、6.16%、29.64%、27.71%和13.83%；IKPS-2主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、果糖、半乳糖、阿拉伯糖組成，各單糖的物質(zhì)的量百分比分別為85.36%、0.67%、0.67%、0.66%、1.07%、4.42%和7.13%；IKPS-3主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、果糖、半乳糖、阿拉伯糖組成，各單糖的物質(zhì)的量百分比分別為16.13%、17.35%、7.02%、12.93%、6.02%、19.05%和21.49%；IKPS-4主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、果糖、半乳糖、阿拉伯糖組成，各單糖的物質(zhì)的量百分比分別為17.62%、4.36%、30.72%、11.73%、4.73%、19.83%和11.00%。

由圖2A可以看出，GC法分析葡萄糖醛酸時(shí)，色譜峰??；分析IKPS樣品時(shí)，未見葡萄糖醛酸的色譜峰，此法難適用于糖醛酸的分析。此外，何玲玲等[9]研究發(fā)現(xiàn)苦丁冬青苦丁多糖由阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖等5種單糖組成，與GC法的分析結(jié)果相近。而采用HPLC法時(shí)，發(fā)現(xiàn)IKPS中不僅含有甘露糖、鼠李糖、果糖、半乳糖等中性糖，還含有不同程度的葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸等糖醛酸。因此與較GC法相比，HPLC法更適合于多糖樣品的單糖組成分析。

表2 8種單糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 2 Calibration curves of 8 monosaccharides

3 結(jié) 論

IKPS粗品通過DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換柱層析分離得到IKPS-1、IKPS-2、IKPS-3和IKPS-4共4個(gè)純化組分，IKPS及其純化組分的單糖組成分析結(jié)果表明IKPS、IKPS-1、IKPS-2、IKPS-3和IKPS-4中均含有甘露糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖醛酸和果糖；除組分IKPS-4外的其他組分均含有葡萄糖，另外IKPS和IKPS-1中還含有巖藻糖；IKPS、IKPS-1和IKPS-4中含有半乳糖醛酸。HPLC法與GC法的結(jié)果基本一致，但HPLC法能檢測到多糖組成中的果糖和糖醛酸信息，結(jié)果更為全面、可靠。

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