葉思平，陳悅嬌，陳海光*，鄧雅哲

(仲愷農(nóng)業(yè)工程學院輕工食品學院，廣東 廣州 510225)

益智仁別名益智子，是姜科山姜屬植物益智(Alpinia oxyphylla Miq.)的干燥果實，夏、秋間果實由綠變紅時采收，曬干或低溫干燥。益智仁具有強心、抗癌、控制回腸收縮等功效[1]，由于其味辛性溫，氣味芳香，常被制成益智棕、蜜餞、粥、飲料等食品，具有開胃、健脾、促進食欲、幫助消化的作用。邸磊等[2]研究表明，益智仁中含有二芳基庚烷類、黃酮、甾體、有機酸等成分。

據(jù)報道，益智含有大量的“聰明因子”——牛磺酸，但益智仁中是否含有?；撬嵩谙嚓P文獻中卻沒得到證實。本實驗用高效液相色譜法測定益智仁中?；撬岷浚瑸橐嬷侨使δ苁称返拈_發(fā)應用提供參考意見。

目前，?；撬釡y定方法有熒光法、氨基酸自動分析法、高效液相色譜法等，而前兩種方法的儀器價格較貴、運行成本較高。本實驗擬采用高效液相色譜法對益智仁中牛磺酸含量進行測定。高效液相色譜法主要有2,4-二硝基氟苯(DNFB)衍生法、單磺酰氯(Dansyl-Cl)衍生法、鄰苯二甲醛(OPA)衍生法等，但前兩者應用試劑較多，且試劑價格昂貴，所以本實驗選用實驗條件最簡便的鄰苯二甲醛衍生法。有關柱前衍生高效液相色譜法測定?；撬岷恳延匈Y料報道[3-4]，采用梯度洗脫測定，費時較長；國家現(xiàn)行標準[5]中，流動相為甲醇-乙腈-水(10：10：80，V/V)時，較難洗脫導致峰型不佳。本實驗采用鄰苯二甲醛作為衍生劑，甲醇-醋酸鈉作為流動相，擬建立測定結果準確，峰型良好，而且便于操作的益智仁中?；撬岷康姆椒?。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

海南益智仁 市購。取10g益智仁，粉碎后過40目篩，加約200mL純凈水，浸泡30min，煮沸后保溫30min，定容至250mL，過濾，濾液作為測定樣品。

?；撬?純度＞98%)、鄰苯二甲醛(OPA)、甲醇(色譜純)、四氫呋喃、硼酸、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀、無水乙酸鈉、乙硫醇分析純、水為二次蒸餾水。

衍生劑配制：稱取0.05g鄰苯二甲醛，用1mL甲醇溶解，加入0.1mL乙硫醇，用硼酸緩沖液(0.4mo1/L、pH9.5、NaOH調(diào)制)定容至10mL，密封后在冰箱中(0～4℃)避光保存；牛磺酸標準溶液：準確稱取0.05g?；撬嵊胮H7.5磷酸緩沖液定容至50mL，即含?；撬?mg/mL；?；撬針藴适褂靡海何∨；撬針藴嗜芤?mL于50mL容量瓶，用磷酸緩沖液定容至刻度，即得0.020mg/mL?；撬針藴适褂靡?。

1100高效液相色譜儀 美國安捷倫科技公司；KQ5200超聲波清洗器 昆山市超聲波儀器有限公司；PHB-4型便攜式數(shù)字pH計 上海精密科學儀器有限公司；TG16-W微量高速離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；XB224電子精密天平 上海精科天美科學儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

移取益智仁樣品20mL于小燒杯中以0.2g活性炭脫色，過濾取4mL于離心管中，1000r/min離心15min，取上清液用微孔慮膜過濾備用。

1.2.2 色譜條件

色譜柱：Eclipse XDB-C18反相柱(150mm×4.6mm，5μm)；流動相：甲醇-0.05mol/L醋酸鈉(65：35，V/V)；流速：1.0mL/min；檢測波長：330nm；進樣體積：10μL；柱溫；27℃。

2 結果與分析

2.1 波長選擇

根據(jù)?；撬釡y定的國家標準，?；撬嵩诓ㄩL為330nm有最大吸收峰，所以本實驗采用330nm為測定波長。

2.2 流動相配比選擇

分別選擇不同配比的流動相，進行?；撬針藴蕵雍蛯嶋H樣品的色譜分離實驗，選用甲醇與0.05mol/L的乙酸鈉作為流動相，分別選擇體積比為55：45、65：35、75：25進行實驗，實驗證明在流速為1.0mL/min下，隨著流動相中甲醇比例的增加，磺酸的出峰時間明顯提前，甲醇-0.05mol/L乙酸鈉(65：35，V/V)的流動相出峰時間為8min左右，分離效果最佳。而體積比為55：45時，出峰時間在20min左右，衍生物已經(jīng)分解，峰值較小，不宜選擇。當比例為75：25時，由于出峰時間在3min左右，出峰時間較早，影響樣品出峰，故選用甲醇-乙酸鈉溶液(65：35，V/V)最佳。而新鮮配制的0.05mol/L乙酸鈉溶液pH值為6.5，可直接使用。

2.3 衍生劑用量的選擇

分別選擇不同用量的衍生劑，對?；撬針藴蕵雍蜆悠愤M行色譜分離實驗。選用10μL質(zhì)量濃度為0.02mg/μL的?；撬針藴嗜芤?，分別與5、10、20、30μL衍生劑混合(即?；撬針藴蕵雍蛯嶋H樣品或衍生劑的比例為2：1、1：1、1：2、1：3)，觀察其峰面積與峰型之間的關系，確定衍生劑與標準液的最佳比例。實驗證明，隨著衍生劑的用量增大，峰面積也逐漸增大，但1：2和1：3的峰型較寬而且出現(xiàn)裂縫現(xiàn)象，所以選用標準液與衍生劑的比例為1：1最佳。

2.4 衍生時間的選擇

本實驗嘗試了標品樣品與衍生劑手動混合、在線自動混合等不同衍生條件。結果表明，樣品與衍生劑在線自動混合可精確控制衍生時間，而且具有衍生反應迅速、靈敏度高，易于實現(xiàn)自動化操作，可編序列連續(xù)進樣等優(yōu)點。但自動混合次數(shù)過多，會導致衍生劑揮發(fā)，影響分離效果。自動混合2次(約30s)，保證1.5min內(nèi)進樣，其測定效果良好，所以本實驗采用衍生時間為30s。

2.5 工作曲線

高效液相色譜儀進樣器吸取質(zhì)量濃度為0、0.004、0.01、0.02、0.04、0.08、0.12、0.16、0.2μg/μL牛磺酸標準溶液10μL，再分別吸取10μL衍生劑，混針2次后進樣，進行HPLC分析，每種分析測定3次，取平均峰面積。在?；撬岬馁|(zhì)量濃度4～58mg/L，?；撬岬馁|(zhì)量濃度與色譜峰面積之間回歸方程為y=1328.03x－47.13，R2=0.9992，結果見圖1。所有試樣以及標準從反應至進樣及標準反應至進樣的時間應保持一致。

圖 1 ?；撬針藴噬V圖Fig.1 Chromatogram of taurine standard

2.6 精密度測試

吸取質(zhì)量濃度0.16μg/μL標準溶液，連續(xù)測定6次，牛磺酸峰面積的RSD值為0.94%。取同一批樣品，按樣品溶液項制備6份，測定牛磺酸峰面積，其RSD為1.01%。

2.7 樣品的測定

取1.2.1節(jié)所配制的樣品溶液，按照上述的實驗方法進行衍生和色譜分析，記錄標準液和樣品峰面積，由峰面積外標法定量，測定結果為益智仁的牛磺酸平均為含量363.0mg/kg，結果見圖2。

圖 2 樣品色譜圖Fig.2 Chromatogram of sample

2.8 加標回收率實驗

在已知含量的樣品中加入3個水平的標準溶液，按照上述實驗方法和色譜條件進樣，計算回收率，平均回收率為104.2%，RSD為2.15%，測定得到的加標回收率見表1。說明本方法較準確。

表1 回收率測試結果Table 1 Recovery of the HPLC method

3 結 論

本實驗建立高效液相色譜測定益智仁中?；撬岷康姆椒?。以甲醇-0.05mol/L的醋酸鈉為流動相，UV-330nm為DAD檢測波長。測定結果表明益智仁中牛磺酸的含量大約363.0mg/kg，其含量較少，可能在制作過程中?；撬岬奶崛÷瘦^低，應從提取工藝上進行改進，以提高益智仁中?；撬岬暮俊Ａ硗?，由于益智仁氣味芳香，味辛性溫，而且具有有開胃、健脾功效，可開發(fā)成其他保健食品。測定益智仁中牛磺酸的質(zhì)量濃度時，本實驗方法具有分離效果好而且操作簡便，靈敏度高，結果準確等優(yōu)點，適合一般實驗室分析。

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