張 倩，郭曉蕓，張海松，范麗平，任國平

(1.杭州萬向職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物技術(shù)系，浙江 杭州 310023；2.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550022)

酸肉是一類有著悠久歷史的乳酸細菌型發(fā)酵肉制品，是侗、苗、布依族等少數(shù)民族居民生活中的重要肉食產(chǎn)品[1]，有著豐富的飲食文化內(nèi)涵。酸肉也是我國少數(shù)民族地區(qū)特色性的發(fā)酵肉制品，由于風(fēng)味獨特、營養(yǎng)豐富、色鮮味美而成為許多少數(shù)民族非常喜愛的一種民間發(fā)酵肉制品[2]。目前，有關(guān)發(fā)酵肉方面的研究報道較多[3-8]，但對其加工過程中理化成分、發(fā)酵代謝產(chǎn)物分析缺乏系統(tǒng)深入的研究，致使酸肉加工過程中的一些關(guān)鍵性技術(shù)問題尚未得到解決，諸如無優(yōu)質(zhì)發(fā)酵劑、無統(tǒng)一的加工技術(shù)標準、產(chǎn)品風(fēng)味與傳統(tǒng)產(chǎn)品的風(fēng)味相比還有差異，從而使其質(zhì)量受到一定影響，在一定程度上限制了酸肉的大規(guī)模現(xiàn)代化生產(chǎn)。國內(nèi)已有學(xué)者對傳統(tǒng)酸肉的微生物菌相變化、找出產(chǎn)品中的優(yōu)勢菌群并篩選性能優(yōu)良的微生物菌種，從而開發(fā)肉用人工發(fā)酵劑的研究開始關(guān)注[9]，生產(chǎn)發(fā)酵肉制品所使用的微生物發(fā)酵劑多數(shù)還依賴進口。酸肉是自然發(fā)酵的肉制品，其中含有多種有益微生物，這些微生物是肉類專用發(fā)酵劑的重要生物資源，具有巨大開發(fā)潛力[10-16]。因此，有必要對不同地域的傳統(tǒng)“酸肉”發(fā)酵體系中理化成分和微生物發(fā)酵產(chǎn)物的動態(tài)變化進行分析。本實驗對貴州荔波當?shù)貍鹘y(tǒng)酸肉發(fā)酵過程中不同階段肉制品的理化成分和微生物發(fā)酵風(fēng)味物質(zhì)進行動態(tài)觀察并分析其變化規(guī)律，以期為傳統(tǒng)酸肉工業(yè)化發(fā)酵過程控制以及酸肉產(chǎn)品質(zhì)量的提高提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇貴州荔波生產(chǎn)銷售量最大的兩種壇裝傳統(tǒng)自然發(fā)酵酸肉，分別標記為傳統(tǒng)酸肉1和傳統(tǒng)酸肉2兩個處理組。每個處理樣品總量為3.5kg(0.35kg×10壇)。從入壇發(fā)酵開始，發(fā)酵60d內(nèi)每隔10d分別從2個處理組中隨機抽出1壇，進行理化分析。

1.2 儀器與設(shè)備

5417R超速離心機 德國Eppendorf公司；L-8800氨基酸自動分析儀 日本Hitachi公司；HP6890/HP5975C型GC/MS聯(lián)用儀 美國安捷倫公司；BS110S型電子天平 北京賽多利斯天平有限公司；HI-98128袖珍型防水pH計 廣州市盛華化工科技有限公司；磁力攪拌器 金壇市大地自動化儀器廠；DK-89-1型恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；722光柵分光光度計 上海分析儀器總廠；D.D.S-300型組織搗碎機 長沙市西區(qū)紅星電器廠；BCD-248W型保鮮冰箱 美萎集團合肥電冰箱廠；CS101-2型電熱鼓風(fēng)干燥箱 重慶實驗設(shè)備廠；KDN-04A定氮儀 上海昕瑞儀器有限公司；LD4-2型低速離心機(4000r/min) 北京醫(yī)用離心機廠。

1.3 方法

1.3.1 pH值的測定

測定方法按照 GB/T 9695.5—2008《肉與肉制品pH測定》規(guī)定的方法，將樣品絞碎后，稱取10g，加入90mL 蒸餾水浸提20min，過濾，取上清液用pH計測定。

1.3.2 水分含量的測定

測定方法按照 GB/T 5009.3—2010《食品中水分的測定》的直接干燥法。

1.3.3 總糖含量的測定

按GB/T 5009.7—2008《食品中還原糖的測定》及GB 9695.31—2008《肉制品總糖含量測定》方法測定。

1.3.4 蛋白質(zhì)含量的測定按照 GB/T 9695.11—2008《肉與肉制品氮含量測定》的凱氏定氮法測定。

1.3.5 脂肪含量的測定按照 GB/T 9695.7—2008《肉與肉制品總脂肪含量測定》的索氏提取法測定。

1.3.6 總酸含量的測定按照馬勇等[17]方法測定。

1.3.7 氨基酸態(tài)氮含量的測定

按照馬勇等[17]的方法測定。

1.3.8 揮發(fā)性鹽基氮含量的測定

采用GB/T 5009.44—2003《肉與肉制品衛(wèi)生標準的分析方法》中的半微量定氮法，計算公式如下：

式中：V1為樣品消耗0.0100mol/L HCl溶液體積/mL；V0為空白實驗消耗0.0100mol/L HCl溶液體積/mL；m為樣品質(zhì)量/g。

1.3.9 游離氨基酸的分析

氨基酸的分析：使用氨基酸分析儀，按照國家標準GB/T 18246—2000《飼料中氨基酸的測定》對上述樣品處理液進行分析。儀器分析條件：4.6×150mm 2619#離子交換色譜；洗脫液流速0.225mL/min；茚三酮流速0.3mL/min；柱壓80～130kg/cm2；茚三酮壓力15～35kg/cm2；氮氣壓力0.28kg/cm2；柱溫53℃；標準樣品濃度3nmol/50μL；每個樣品的分析時間為74min。

1.3.10 風(fēng)味成分分析

酸肉樣品提?。喝∵m量發(fā)酵結(jié)束后的終產(chǎn)品，切碎，加經(jīng)重蒸后的AR級正己烷5mL，回流提取1.5h，分離正己烷溶液，提取酸肉風(fēng)味成分。

氣相條件：色譜柱為AB-INowax (30.0m×250μm， 0.25μm)彈性石英毛細管柱，柱溫45℃(保留2min)，以5℃/min升溫至240℃，保持15min；汽化室溫度250℃；載氣為高純He(99.999%)；柱前壓5.08psi，載氣流量1.0mL/min；進樣量2μL(正己烷溶液)；分流比20：1。

質(zhì)譜條件：電子電離源(electron ionization，EI)；離子源溫度230℃；四極桿溫度150℃；電子能量70eV；發(fā)射電流34.6μA；倍增器電壓982V；接口溫度280℃；質(zhì)量范圍m/z 20～450。

1.3.11 有害物質(zhì)檢測[18]

H2S測定：有些細菌可分解培養(yǎng)基中含硫化合物，從而產(chǎn)生硫化氫氣體，硫化氫遇鉛鹽或低鐵鹽可生成黑色沉淀物。采用硫化亞鐵瓊脂培養(yǎng)基。挑取被測液體，沿管壁穿刺，于(36±1)℃條件下培養(yǎng)1～2d觀察，產(chǎn)硫化氫者使培養(yǎng)基變?yōu)楹谏?/p>

吲哚測定：某些細菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚與對二甲基氨基苯醛結(jié)合，形成玫瑰紅色吲哚化合物。試驗采用蛋白胨水作為培養(yǎng)基，挑取少量被測液體接種于培養(yǎng)基內(nèi)，于(36±1)℃條件下培養(yǎng)1～2d，必要時可培養(yǎng)4～5d，加入歐-波試劑約0.5mL，沿管壁流下，覆蓋于培養(yǎng)液表面，陽性者與液面接觸處呈玫瑰紅色。

亞硝酸鹽測定：采用亞硝酸鹽試劑盒比色法。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH值變化

從圖1可以看出，傳統(tǒng)酸肉在0～10d環(huán)境中營養(yǎng)豐富，條件適宜，多種微生物都能得到生長繁殖的機會，乳酸菌生長迅速[19]，環(huán)境中的pH值急劇下降；10～30d時，厭氧和兼性厭氧微生物成為優(yōu)勢菌，產(chǎn)酸速度逐漸減緩，從而在20～30d內(nèi)將pH值維持在穩(wěn)定的范圍內(nèi)；30～45d內(nèi)，pH值持續(xù)下降。此時，pH值達到最低(pH3.85)，酸度口感適宜；45～60d時，pH值出現(xiàn)回升現(xiàn)象，這是微生物分解蛋白質(zhì)，產(chǎn)生了一些氨及胺類等堿性含氮物質(zhì)的結(jié)果[19]。

圖 1 荔波傳統(tǒng)酸肉發(fā)酵期間pH值的變化Fig.1 pH change of Libo sour meat during fermentation period

2.2 水分含量的變化

圖 2 荔波傳統(tǒng)酸肉發(fā)酵期間水分含量的變化Fig.2 The change of water content in Libo sour meat during fermentation period

圖2表明，在整個發(fā)酵期，水分呈現(xiàn)總體下降的趨勢，其中以前40d最為明顯。荔波傳統(tǒng)酸肉的初始水分含量為56.32%，最終產(chǎn)品的水分含量為40.22%。水分下降速率前40d較快，以后略有所下降。這主要是由于發(fā)酵過程中乳酸菌生長迅速[19]，產(chǎn)品的pH值下降快，從而使得產(chǎn)品失水較快。

2.3 總糖含量的變化

圖 3 荔波傳統(tǒng)酸肉發(fā)酵過程中總糖含量的變化Fig.3 The change of total sugar in Libo sour meat during fermentation period

由圖3可知，發(fā)酵過程中，總糖的含量總體呈下降趨勢，在發(fā)酵前40d下降迅速，由1.11%下降到0.63%，以后持續(xù)緩慢下降，趨于穩(wěn)定。說明總糖發(fā)生了分解，產(chǎn)生的酸增加。

2.4 蛋白質(zhì)含量的變化

圖 4 荔波傳統(tǒng)酸肉發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)含量的變化Fig.4 The change of protein content in Libo sour meat during fermentation period

由圖4可知，在傳統(tǒng)酸肉的發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)一直呈上升的趨勢，新鮮豬肉(即0d時)的蛋白質(zhì)含量是最低的，隨著發(fā)酵時間的延長，微生物的增殖以及水分的減少，蛋白質(zhì)含量相應(yīng)增加，從初始的13.02%一直增加到60d時的18%左右。總氮變化與蛋白質(zhì)的降解和微生物代謝產(chǎn)生的一些含氮化合物有關(guān)[4]。

2.5 脂肪含量的變化

圖 5 荔波傳統(tǒng)酸肉發(fā)酵過程中脂肪含量的變化Fig.5 The change of fat content in Libo sour meat during fermentation period

在傳統(tǒng)酸肉的發(fā)酵過程中脂肪一直呈上升的趨勢，到發(fā)酵完成后脂肪含量可達31.20%(圖5)，可能主要是因為微生物生長代謝更新[19]，大量積累微生物菌體，而微生物細胞壁的磷脂層使得脂肪含量上升；脂肪含量的增加也與水分的減少有關(guān)?？傊咀兓怯芍镜难趸徒到猱a(chǎn)生的一些脂類化合物引起的[5]。

2.6 總酸含量的變化

由圖6可知，2個處理中傳統(tǒng)酸肉在自然發(fā)酵10d內(nèi)總酸含量降低，此后隨pH值的降低而上升，說明pH值在一定程度上反映總酸含量的高低。但兩者并非一一對應(yīng)，有時pH值增大而總酸含量增加，因為pH值僅表示酸肉中游離氫離子(H+)的多少，而總酸為各種酸性物質(zhì)的總和，包括乳酸和其他酸性物質(zhì)。

圖 6 荔波傳統(tǒng)酸肉發(fā)酵過程中總酸含量的變化Fig.6 The change of total acid content in Libo sour meat during fermentation period

2.7 氨基酸態(tài)氮含量的變化

圖 7 荔波傳統(tǒng)酸肉發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮含量的變化Fig.7 The change of amino nitrogen in Libo sour meat during fermentation period

由圖7可知，2個處理中傳統(tǒng)酸肉在自然發(fā)酵40d內(nèi)氨基態(tài)氮含量呈緩慢上升趨勢(20mg/100g上升到第45天的50mg/100g以上)，然而在發(fā)酵的40～60d內(nèi)以較快速度上升到132.45mg/100g。蛋白質(zhì)在發(fā)酵微環(huán)境及肌肉蛋白酶的共同作用下降解產(chǎn)生游離氨基酸和多肽，另外，與部分氨基酸脫羧、脫氨或進一步代謝生成醛、酮及其他小分子化合物也有一定關(guān)系，這些肉蛋白的降解產(chǎn)物能促進風(fēng)味形成，同時也是進一步產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)的底物，發(fā)酵后酸肉氨基酸態(tài)氮含量增加顯著，表明發(fā)酵能提高肉制品的營養(yǎng)價值與風(fēng)味。

2.8 揮發(fā)性鹽基氮含量的變化

圖 8 荔波傳統(tǒng)酸肉發(fā)酵過程中揮發(fā)性鹽基氮含量的變化Fig.8 The change of volatile salt-basic nitrogen in Libo sour meat during fermentation period

在酸肉發(fā)酵過程中，由于蛋白質(zhì)和脂肪的變化，賦予肉獨特的風(fēng)味，同時也會造成肉的腐敗變質(zhì)。在肉的腐敗過程中，蛋白質(zhì)分解而產(chǎn)生的氮以及胺類等堿性含氮物質(zhì)即揮發(fā)性鹽基氮。2個處理中傳統(tǒng)酸肉在自然發(fā)酵的前30d，揮發(fā)性鹽基氮含量變化緩慢，從第45天開始，揮發(fā)性鹽基氮含量上升趨勢明顯，在第60天時的含量達到80.86mg/100g(圖8)。

2.9 游離氨基酸的分析

在傳統(tǒng)酸肉1發(fā)酵過程中，分別測定了原料肉和發(fā)酵60d酸肉的氨基酸，通過對比分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氨基酸總量增加(表1)，7種必需氨基酸總含量由發(fā)酵前的8.02g/100g，增加到發(fā)酵后的21.96g/100g，在一定程度上提高了產(chǎn)品的營養(yǎng)價值。與發(fā)酵前相比，大部分氨基酸含量都提高了，其中谷氨酸含量增加最多，其次是甘氨酸、蛋氨酸和賴氨酸等，表明肉類經(jīng)過發(fā)酵后的營養(yǎng)價值更高。

表 1 發(fā)酵前后傳統(tǒng)酸肉的氨基酸組成和含量Table 1 The compositions and contents of amino acids in traditional sour meat before and after fermentation

2.10 風(fēng)味物質(zhì)的變化

采用氣相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用的方法，對荔波傳統(tǒng)酸肉的風(fēng)味物質(zhì)進行分析比較，以下是傳統(tǒng)酸肉發(fā)酵后揮發(fā)性風(fēng)昧物質(zhì)總離子流色譜圖(圖9)，分析結(jié)果列于表2中。

圖 9 傳統(tǒng)酸肉揮發(fā)性風(fēng)味化合物GC-MS總離子圖Fig.9 Total ion current chromatogram of volatile compounds from traditional sour meat

根據(jù)總離子流圖可明顯分離出34種主要化合物。其中酸類15種、醛類11種、烷烴類1種、烯類1種、酯類3種、醇類3種，其中酸類最多，占總組分的44%，說明傳統(tǒng)酸肉主要以酸味物質(zhì)為主。

表 2 傳統(tǒng)酸肉主要揮發(fā)性化合物組成與分子特性Table 2 Volatile compounds and relative contents in traditional sour meat

2.11 有害成分分析

表 3 有害成分檢測結(jié)果Table 3 The results of microbiological hygiene index

腐生菌能產(chǎn)生大量的吲哚、硫化氫、胺和酚等代謝產(chǎn)物，這些產(chǎn)物在肝臟中通過酸解毒，隨尿以葡糖醛酸鹽和硫酸鹽等形式排出，如果不能及時解毒，將導(dǎo)致肝功能紊亂和循環(huán)系統(tǒng)異常，干擾神經(jīng)系統(tǒng)并影響睡眠[20]。由表3可知，在傳統(tǒng)酸肉中H2S、吲哚均未檢出。發(fā)酵肉制品中都含有一定量的亞硝酸鹽，大量食用亞硝酸鹽后會導(dǎo)致人中毒，傳統(tǒng)酸肉中的亞硝酸鹽含量達到0.009g/100g，超出了國標要求，存在一定的安全隱患。

3 結(jié) 論

貴州荔波傳統(tǒng)酸肉在發(fā)酵期間理化成分中的大分子物質(zhì)含量變化趨勢不同，總糖含量減少，與酸含量的顯著增加呈正相關(guān)，發(fā)酵成熟時pH值在3.60左右，蛋白質(zhì)和脂肪含量的增加與發(fā)酵期間微生物的繁殖和水分的減少有關(guān)，發(fā)酵產(chǎn)物總酸、氨基酸態(tài)氮、游離氨基酸與揮發(fā)性鹽基氮的含量都呈逐漸上升趨勢，表明大分子物質(zhì)在逐步降解，酸肉的最終水分含量在40%左右；酸肉中的風(fēng)味物質(zhì)包含多種成分，主要有酸類、醛類、酯類、醇類等；有害成分分析發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)酸肉中吲哚、硫化氫均未檢出，亞硝酸鹽含量(0.009g/100g)高于國家標準，因而傳統(tǒng)酸肉存在一定的安全隱患。

[1] 車科, 麻成金, 黃群, 等. 湘西傳統(tǒng)酸肉乳酸菌分離、篩選及鑒定[J]. 中國釀造, 2008(11)： 25-28.

[2] 李宗軍, 江漢湖, 李紅瓊. 湘西侗族傳統(tǒng)發(fā)酵肉的產(chǎn)品特性[J]. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報： 自然科學(xué)版, 2002, 28(1)： 61-63.

[3] 馬菊, 孫寶忠, 郝永清. 國內(nèi)外發(fā)酵肉制品歷史及發(fā)展現(xiàn)狀比較[J]. 肉類研究, 2006, 20(9)： 45-47.

[4] GIUSEPPE C, ROSALINDA U, LUCILLA I. Characterisation of naturally fermented sausages produced in the North East of Italy[J].Meat Science, 2005(3)： 381-392.

[5] LEE J Y, KIMB C J, KUNZ B. Identification of lactic acid bacteia isolated from kimchi and studies on their suitability for application as starter culture in the production of fermented sausages[J]. Meat Science, 2006(3)： 437-445.

[6] BOLUMAR T, SANZ Y,FLORES M. Sensory improvement of dry-fermented sausages by the addition of cell-free extracts from Debaryomyces hansenii and Lactobacillus sakei[J]. Meat Science, 2006(3)： 457-466.

[7] 吳祖興, 張華. 發(fā)酵肉制品乳酸菌菌種篩選研究[J]. 食品科學(xué), 2003, 24(9)： 43-47.

[8] 盧士玲, 吳桂春, 李開雄. 發(fā)酵肉制品中乳酸菌的分離鑒定技術(shù)的研究[J]. 肉類工業(yè), 2005(11)： 16-2l.

[9] 李宗軍, 江漢湖. 中國傳統(tǒng)酸肉發(fā)酵過程中微生物的消長變化[J]. 微生物學(xué)通報, 2004, 31(4)： 9-13.

[10] 李華麗. 酸肉生產(chǎn)主發(fā)酵期發(fā)酵條件的確定[J]. 中國食物與營養(yǎng), 2005(4)： 41-43.

[11] 李宗軍. 中國傳統(tǒng)酸肉中葡萄球菌的分離鑒定與應(yīng)用研究[J]. 生物技術(shù)通報, 2006(3)： 77-80.

[12] 李宗軍, 江漢湖. 肉品微生態(tài)系統(tǒng)與肉類發(fā)酵劑研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 200l, 28(5)： 54-59.

[13] 劉麗莉, 楊協(xié)力. 發(fā)酵肉制品中乳酸菌菌種篩選研究[J]. 農(nóng)業(yè)機械學(xué)報, 2006, 37(8)： 229-231.

[14] NORDA1 J, SLINDE E. Characteristic of some lactic acid bacteria used as starter cultures is dry sausage production[J]. Applied Environ Microbial, 1980, 40(9)： 472-475.

[15] GRECO M, MAZZETTE R. Evolution and identification of lactic acid bacteria isolated during the ripening of Sardinian sausages[J]. Meat Science, 2005(7)： 733-739.

[16] PENNACCHIA C, VAUGHAN E. Potential probiotic lactobacillus strains from fermented sausages. Further investigations on their probiotic properties[J]. Meat Science, 2005(10)： 19-25.

[17] 馬勇, 王家槐, 等. 腐乳生產(chǎn)過程中食鹽對蛋白質(zhì)、脂肪水解的影響[J]. 中國釀造, 2002(1)： l5-l8.

[18] 魏明奎, 段鴻斌. 食品微生物檢驗技術(shù)[M]. 北京： 化學(xué)工業(yè)出版社, 2002： 94-104.

[19] 郭曉蕓, 龍江, 張亮, 等. 貴州荔波傳統(tǒng)酸肉微生物菌群與營養(yǎng)品質(zhì)評價[J]. 中國釀造, 2009(7)： 69-71.

[20] 劉弘, 高圍溦. 食源性疾病與食物中毒[J]. 上海預(yù)防醫(yī)學(xué), 2003, 15(1)： 3-4.