趙 磊，唐 婧，王成濤*

(北京工商大學(xué) 食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100048)

脂肪酶(EC3.1.1.3)，即三?；视王；饷?，它能在油水界面上催化酯水解和醇解、酯合成、酯交換、內(nèi)酯合成及高聚物合成等有機(jī)合成反應(yīng)，是目前被重點(diǎn)研究的酶催化劑[1]。脂肪酶廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)、藥物合成、農(nóng)用化學(xué)品工業(yè)、油脂化學(xué)品工業(yè)、日用化學(xué)工業(yè)以及洗滌和生物表面活性劑的合成等各種生物技術(shù)領(lǐng)域[2]。已有文獻(xiàn)報(bào)道采用脂肪酶催化合成乳化劑(糖酯)、表面活性劑、蠟酯及芳香酯等重要的工業(yè)產(chǎn)品[3]。

游離酶在工業(yè)生產(chǎn)中常表現(xiàn)出低的生物活性和穩(wěn)定性，這在很大程度上限制了酶在工業(yè)中的應(yīng)用[4]。這些缺點(diǎn)往往可通過酶的固定化克服。與游離酶相比，通常固定化酶有著較高的溫度、pH值及操作穩(wěn)定性[5]。硅藻土、離子交換樹脂等顆粒狀物質(zhì)是廣泛使用的固定化酶載體[6-7]。顆粒狀固定化酶雖然具有許多優(yōu)越特性并可經(jīng)過濾回收使用，但仍存在一些問題限制其大規(guī)模使用，如：1)通常高成本，2)在兩相系統(tǒng)中經(jīng)攪拌容易破碎[6]，3)不能用于固定床反應(yīng)器[8-9]。目前，作為替代球狀載體的海綿狀、纖維狀、膜狀、蜂窩狀等片狀載體已在工業(yè)生產(chǎn)上開發(fā)應(yīng)用[10-11]。尼龍結(jié)構(gòu)類似多肽，經(jīng)部分酸水解活化后產(chǎn)生游離氨基和羧基，可通過戊二醛與酶共價(jià)結(jié)合[12]，對(duì)酶具有保護(hù)作用，而且生產(chǎn)成本低廉、無毒、穩(wěn)定性良好、易獲得。已有報(bào)道[13-17]成功將脲酶、葡萄糖氧化酶、糖化酶、堿性蛋白酶等固定于尼龍網(wǎng)上，并對(duì)其固定化后的酶學(xué)性質(zhì)及穩(wěn)定性進(jìn)行了研究。然而，對(duì)脂肪酶在尼龍網(wǎng)上固定化的研究較少，僅黎春怡等[18]對(duì)固定化豬胰脂肪酶條件進(jìn)行了優(yōu)化，但尚未對(duì)其固定化后的酶學(xué)性質(zhì)及穩(wěn)定性進(jìn)行研究。此外，微生物脂肪酶比動(dòng)物脂肪酶具有更廣的作用pH值和溫度范圍，并且便于進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)而更具優(yōu)越性。

本研究以尼龍網(wǎng)作為載體，戊二醛為交聯(lián)劑，采用共價(jià)交聯(lián)對(duì)微生物脂肪酶(Candida sp. 99-125)進(jìn)行固定化，并研究固定化條件和固定化酶的酶學(xué)性質(zhì)及穩(wěn)定性。以期為尼龍網(wǎng)固定化脂肪酶的工業(yè)化應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

假絲酵母脂肪酶(Candida sp. 99-125) 北京化工大學(xué)譚天偉教授惠贈(zèng)；尼龍網(wǎng)(200目)、橄欖油 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Scientz-IID型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；ALC-1100.2分析天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；數(shù)顯電子恒溫水浴鍋 金壇市至翔科教儀器廠；PHS-3D pH計(jì) 上海三信儀表廠；HZS-H水浴振蕩器 哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 載體的處理與脂肪酶的固定化

剪取1cm×1cm的尼龍，將尼龍膜浸入18.6g/100mL CaCl2-18.6%水的甲醇溶液10min，輕輕攪拌，洗凈晾干，后在4mol/L的HCl中水解40min，使膜邊緣卷曲，水洗至中性，晾干。將處理好的膜在一定體積分?jǐn)?shù)的戊二醛磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中交聯(lián)適當(dāng)時(shí)間，用pH7.0的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3～4次以除去未反應(yīng)的戊二醛，晾干，得固定化膜載體。

精確稱取酶粉，用0.1mol/L的PBS配成一定質(zhì)量濃度酶液。將膜載體(1cm×1cm)浸潤(rùn)在酶液中，4℃放置一定時(shí)間，PBS液洗脫至洗脫液在280nm波長(zhǎng)處無光吸收，得固定化脂肪酶，并將其在4℃條件下保存。

1.3.2 脂肪酶活力測(cè)定[19]

分別移取5mL 0.025mol/L磷酸緩沖液(pH7.0)和4mL聚乙烯醇橄欖油乳化液，置于40℃水浴中保溫5min，然后加入脂肪酶，繼續(xù)保溫15min，取出立即加入95%乙醇15mL，以停止酶作用，再加酚酞指示劑3滴，用0.05mol/L氫氧化鈉滴定至溶液呈粉紅色為止。對(duì)照組先不加酶液，也繼續(xù)保溫15min后，立即取出，各加入15mL 95%乙醇，然后再加入脂肪酶。

聚乙烯醇橄欖油乳化液的制備：稱取40g聚乙烯醇，加蒸餾水約1L，在小火上加熱，并不停攪拌，至聚乙烯醇全部溶解，冷卻后定容至1L。用雙層紗布過濾，濾液備用。取4%聚乙烯醇溶液150mL，加50mL橄欖油，超聲處理6min，即成乳白色聚乙烯醇橄欖油乳化液，保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

酶活力以國(guó)際單位表示，即在一定條件下，脂肪酶水解脂肪每分鐘產(chǎn)生1μmol脂肪酸的酶量定為一個(gè)國(guó)際單位。

式中：V樣品為樣品消耗堿液體積/mL；V對(duì)照為對(duì)照組消耗堿液體積/mL；c為堿液濃度/(μmol/mL)；f為稀釋倍數(shù)；t為作用時(shí)間/min。

1.3.3 酶學(xué)性質(zhì)的測(cè)定

1.3.3.1 最適溫度

將游離酶或固定化酶加入底物溶液(pH7.0)中，于不同溫度下(30～60℃，間隔5℃進(jìn)行變化)進(jìn)行反應(yīng)，其他步驟同脂肪酶活力測(cè)定。分別以游離酶和固定化酶的最高活力為100%，進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.3.3.2 熱穩(wěn)定性

取游離酶或固定化酶置于0.1mol/L，pH7.0的PBS緩沖液中，靜置于恒溫箱(30、35、40、45、50、55、60℃)中，20min后取出，測(cè)定酶活力。分別以游離酶和固定化酶的最高活性為100%，進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.3.3.3 半衰期(t1/2)

固定化酶的使用穩(wěn)定性常用t1/2表示，即固定化酶活力下降為最初活力一半所經(jīng)歷的連續(xù)工作時(shí)間。根據(jù)Arrhenius公式：

式中：at為t時(shí)刻酶的活力/(U/cm2)；a0為0時(shí)刻酶的活力/(U/cm2)；Kd為衰減常數(shù)。

當(dāng)溫度一定時(shí)，以ln(at/a0)對(duì)時(shí)間t作圖為直線，其斜率為－Kd。一定溫度下酶的半衰期為：t1/2=0.693/Kd。本實(shí)驗(yàn)采用聚乙烯醇橄欖油乳化液作為底物，取一定量游離酶和固定化酶，放入pH7.0的磷酸鹽緩沖溶液中50℃保溫，間隔一定時(shí)間取出測(cè)定其酶活，并依據(jù)公式(2)求出半衰期。

1.3.3.4 最適pH值

將游離酶或固定化酶置于pH值為2.0～10.0的不同pH值緩沖液配制的底物溶液中，于40℃進(jìn)行反應(yīng)，其他步驟同脂肪酶活力測(cè)定。分別以游離酶和固定化酶的最高活性為100%，進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.3.3.5 pH值穩(wěn)定性

取游離酶或固定化酶，分別于pH值為2.0～10.0的磷酸鹽緩沖溶液中40℃溫育2h后，取出酶測(cè)定其活性，其他步驟同脂肪酶活力測(cè)定。分別以游離酶和固定化酶的最高活性為100%，進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.3.3.6 操作穩(wěn)定性

以橄欖油為底物，pH7.0的磷酸鹽緩沖溶液為溶劑，取面積為10cm2的固定化脂肪酶作為催化劑，在40℃、搖床轉(zhuǎn)速為150r/min條件下水解反應(yīng)15min，測(cè)定其初始酶活后用磷酸鹽緩沖溶液沖洗干凈，并拭干水分后重復(fù)使用，通過考察酶殘留活性隨使用次數(shù)的變化，研究酶的操作穩(wěn)定性。

1.3.3.7 脂肪酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)測(cè)定

用聚乙烯醇橄欖油乳化液作為底物，取一定量游離酶和固定化酶，選用不同底物濃度在40℃、pH7.0條件下測(cè)定酶促反應(yīng)初速率，用雙倒數(shù)作圖(Lineweaver-Burk)法求出相對(duì)應(yīng)的Km及Vmax。

由式(3)可知1/[V]和1/[S]呈線性關(guān)系，故以1/[V]對(duì)1/[S]作圖得一直線，根據(jù)其斜率及縱軸截距即可求得反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km及Vmax。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶的固定化條件

2.1.1 戊二醛體積分?jǐn)?shù)對(duì)固定化酶活力的影響

圖 1 戊二醛體積分?jǐn)?shù)(A)、交聯(lián)時(shí)間(B)、脂肪酶質(zhì)量濃度(C)和固定化時(shí)間(D)對(duì)脂肪酶固定化的影響Fig.1 Effects of glutaraldehyde concentration (A), cross-linking time (B), lipase concentration (C) and immobilization time (D) on activity of immobilized lipase

作為一種交聯(lián)劑，戊二醛能夠與載體和酶上的—NH2基團(tuán)反應(yīng)，從而在酶分子內(nèi)部以及酶與載體之間形成化學(xué)鍵[20]。由圖1A可知，隨著戊二醛體積分?jǐn)?shù)的增加固定化酶活力很快的上升。當(dāng)交聯(lián)劑戊二醛體積分?jǐn)?shù)到達(dá)3%時(shí)，酶活力到達(dá)最大值3.50U/cm2，并且趨于穩(wěn)定。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用3%戊二醛為宜。

2.1.2 交聯(lián)時(shí)間對(duì)固定化酶活力的影響

由圖1B可知，戊二醛可迅速地與酶分子上的—NH2基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)。在反應(yīng)初始階段，反應(yīng)速度非?？欤⒃?0min時(shí)固定化酶活力達(dá)到最大值。隨后，由于參與反應(yīng)過程的—NH2基團(tuán)數(shù)量不再發(fā)生變化，繼續(xù)延長(zhǎng)交聯(lián)時(shí)間至180min，對(duì)提高固定化脂肪酶活力無顯著影響。故后續(xù)試驗(yàn)中戊二醛交聯(lián)時(shí)間以60min為宜。

2.1.3 脂肪酶質(zhì)量濃度對(duì)固定化酶活力的影響

由圖1C可知，在尼龍網(wǎng)上的結(jié)合位點(diǎn)飽和前，隨著脂肪酶質(zhì)量濃度(≤10mg/mL)的增加固定化酶活力也隨之增加。當(dāng)脂肪酶質(zhì)量濃度到達(dá)10mg/mL時(shí)，尼龍網(wǎng)上的結(jié)合位點(diǎn)達(dá)到飽和，脂肪酶活力達(dá)到最大值3.57U/cm2，并達(dá)到平穩(wěn)狀態(tài)，繼續(xù)增加脂肪酶質(zhì)量濃度并不能提高固定化酶活力。因此，后續(xù)試驗(yàn)中選擇10mg/mL質(zhì)量濃度酶液進(jìn)行固定化。

2.1.4 固定化時(shí)間對(duì)固定化酶活力的影響

由圖1D可知，當(dāng)固定化時(shí)間為1h時(shí)，固定化酶活力幾乎為零。隨著固定化時(shí)間的延長(zhǎng)，單位酶活力也逐漸增大，當(dāng)固定化時(shí)間到達(dá)6h，酶活力達(dá)到最大值(3.33U/cm2)，并趨于平穩(wěn)。這表明，固定化時(shí)間達(dá)到6h時(shí)尼龍網(wǎng)上的酶結(jié)合活性位點(diǎn)達(dá)到飽和。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中固定化時(shí)間以6h為宜。

2.2 固定化酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.2.1 最適溫度

圖 2 游離酶和固定化酶的最適溫度(A)和溫度穩(wěn)定性(B)Fig.2 Effects of temperature on the activity (A) and stability (B) of free and immobilized lipase

由圖2A可知，游離酶的最適溫度為45℃，而固定化酶的最適溫度為50℃。該脂肪酶固定化后最適溫度升高，這可能是由于載體的保護(hù)作用，使酶在固定化后對(duì)熱變性作用不敏感。當(dāng)溫度低于45℃時(shí)，游離酶的酶活力高于固定化酶，這可能與酶固定化到載體上后產(chǎn)生分子擴(kuò)散阻力及構(gòu)象改變有關(guān)。當(dāng)溫度高于50℃時(shí)，游離酶和固定化酶的酶活力均顯著下降，這可能由于隨著溫度的升高，聚集的酶分子被打開最終使其失去活性。酶固定化后最適溫度升高的現(xiàn)象在固定化酶中普遍存在[21-23]。

2.2.2 溫度穩(wěn)定性

游離酶和固定化酶分別置于不同溫度保溫20min，然后測(cè)定酶活力。由圖2B可知，該酶置于30℃存放20min后的酶活力較45℃存放時(shí)降低的多，分析原因可能是該酶屬于冷不穩(wěn)定酶，這類酶在較低溫度條件下易于失活，這大多是由于它們?cè)谳^低溫度易于解離成亞基。該結(jié)果與Ding Liang[24]和Kandasamy[25]等報(bào)道的相似。與游離酶相比，固定化酶可以在更高的溫度下保持其活性。這表明，固定化酶的熱穩(wěn)定性得到了顯著提高。在60℃，固定化酶仍保持其初始酶活力的40%，而游離酶活力僅殘余4%。這主要是由于脂肪酶經(jīng)固定化后，載體結(jié)構(gòu)對(duì)酶分子起到保護(hù)作用，并且載體與酶、酶與酶之間的位點(diǎn)交聯(lián)降低了酶結(jié)構(gòu)對(duì)溫度的敏感性，使酶構(gòu)象不易伸展失活。同時(shí)，固定化減少了酶分子內(nèi)部基團(tuán)的熱震動(dòng)，增加了酶結(jié)構(gòu)對(duì)溫度變化的耐受能力，故有效降低了酶活力因外界溫度變化帶來的影響。

2.2.3 半衰期t1/2

圖 3 游離酶和固定化酶的半衰期曲線Fig.3 Half-life curves of free and immobilized lipase

t1/2是用于描述酶熱穩(wěn)定性的另一重要參數(shù)。由圖3可知，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，固定化酶活力逐漸下降，根據(jù)斜率求得固定化酶在50℃時(shí)的半衰期為239min。與之相比，游離酶活力隨時(shí)間的增加迅速下降，根據(jù)斜率求得游離酶在50℃時(shí)的半衰期為24min。固定化酶的半衰期是游離酶的9.86倍，其穩(wěn)定性明顯高于游離酶。這與酶與載體之間形成共價(jià)鍵，從而阻止酶在較高溫度下的構(gòu)象變化有關(guān)[26-27]。

2.2.4 最適pH值

圖 4 游離酶和固定化酶的最適pH值(A)和酸堿穩(wěn)定性(B)Fig.4 Effects of pH on the activity (A) and stability (B) of free and immobilized lipase

圖4A顯示了游離酶和固定化酶的最適pH值，游離酶和固定化酶的最適pH值均為7.0，脂肪酶經(jīng)固定化后其最適pH值并未發(fā)生變化，但固定化酶在pH 5.0～7.0的范圍內(nèi)均保持非常高的活性，這可能與載體尼龍?zhí)峁┑奈h(huán)境保護(hù)作用有關(guān)。由于與載體的靜電相互作用，通常使固定化酶的微環(huán)境和主體溶液氫離子和氫氧根離子濃度分配不同，從而其pH值譜圖產(chǎn)生位移[28-29]。通常，當(dāng)酶固定在陰離子載體上時(shí)，其最適pH值一般向堿性一側(cè)移動(dòng)，反之則向酸性一側(cè)移動(dòng)[30]。

2.2.5 pH值穩(wěn)定性

由圖4B可知，固定化酶活力隨pH值變化改變緩慢，并較游離酶有著較好的pH值穩(wěn)定性。在pH5.0～7.0范圍內(nèi)，游離酶可以保持其初始酶活力的90%以上；相比之下，固定化脂肪酶對(duì)pH值變化不敏感，可在更寬的pH值范圍內(nèi)(pH3.0～9.0)保持90%以上的初始酶活。當(dāng)pH值為10.0時(shí)，固定化酶酶活力僅降低24%，而游離酶酶活力卻降低了58%；當(dāng)pH值為2.0時(shí)，固定化酶活力僅降低39%，而游離酶活力卻降低了54%。酶經(jīng)固定化后可以顯著提高其pH值穩(wěn)定性已被廣泛證實(shí)[31-32]。

2.2.6 操作穩(wěn)定性

圖 5 固定化酶的操作穩(wěn)定性Fig.5 Operation stability of immobilized lipase

經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn)，測(cè)試固定化脂肪酶水解橄欖油的操作穩(wěn)定性，結(jié)果見圖5。在連續(xù)使用5個(gè)批次后固定化酶仍保持73%的初始酶活力。重復(fù)使用一次后，固定化脂肪酶活力較初始值降低了21%，并在后續(xù)4次使用后保持不變。經(jīng)5次使用后酶活力的降低可能與酶從基質(zhì)上泄漏或固定化基質(zhì)表面形成乳狀液薄膜有關(guān)[33]。該固定化酶表現(xiàn)出了良好的操作穩(wěn)定性，這對(duì)于高效率地利用催化劑，降低操作成本有著重要意義。

2.2.7 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)

圖 6 游離酶和固定化酶的Lineweaver-Burk曲線Fig.6 Lineweaver-Burk plots of free and immobilized lipase

游離酶和固定化酶水解橄欖油的Lineweaver-Burk曲線如圖6所示，線性回歸系數(shù)分別為0.973和0.995。經(jīng)計(jì)算得出，游離酶和固定化酶的米氏常數(shù)(Km值)分別為0.21mol/L和0.57mol/L；最大反應(yīng)速率(Vmax)分別為0.34×10-4mol/(L·s)和0.29×10-3mol/(L·s)。固定化酶的表觀Km和Vmax均高于游離酶。表觀米氏常數(shù)Km所反映出的是酶與底物的親和能力，Km越小說明酶與底物親和能力越強(qiáng)。結(jié)果顯示，游離酶的Km小于固定化酶，說明游離酶對(duì)底物的親和力要優(yōu)于固定化酶。這主要是因?yàn)槊附?jīng)固定化后，載體的存在增大了酶周圍的空間位阻，加大了底物與載體上酶蛋白分子活性中心的結(jié)合阻力，故降低了底物與酶的親和能力，故Km值升高。與Km的結(jié)論不同，固定化酶最大反應(yīng)速率Vmax遠(yuǎn)大于游離酶。說明要達(dá)到同樣的催化效果，固定化酶所需時(shí)間要短于游離酶。

3 結(jié) 論

以尼龍網(wǎng)為載體、戊二醛為交聯(lián)劑，脂肪酶(Candida sp. 99-125)最適固定化條件為：戊二醛體積分?jǐn)?shù)3%、交聯(lián)時(shí)間60min、脂肪酶質(zhì)量濃度10mg/mL、固定化時(shí)間6h。

與游離酶相比，固定化酶的最適溫度從45℃提高至50℃，最適pH值相同，均為7.0，并在pH5.0～7.0范圍內(nèi)均有非常高的活力。脂肪酶經(jīng)固定化后，其熱穩(wěn)定性、pH值穩(wěn)定性、最大反應(yīng)速率均得到了一定程度的提高。固定化酶的Km值為0.57mol/L，高于游離酶的Km值(0.21mol/L)，與底物親和力略有降低。經(jīng)過5次重復(fù)操作使用后，固定化酶的活力仍保持在80%左右，具有良好的操作穩(wěn)定性。

利用化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，成本低廉的尼龍網(wǎng)固定脂肪酶，操作簡(jiǎn)便、易于保存，而且酶的穩(wěn)定性良好，利用率高，為工業(yè)化應(yīng)用脂肪酶奠定了基礎(chǔ)。

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