呂海鵬，張 悅，費(fèi)冬梅，林 智*

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，國(guó)家茶產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)研究中心，浙江 杭州 310008)

近年來(lái)，茶葉中的甲基化兒茶素成分因其有顯著的抗氧化、抗衰老、抗過(guò)敏等功效引起了科研工作者的關(guān)注；目前已在相關(guān)資源篩選[1-2]、基因克隆[3-4]以及生物活性評(píng)價(jià)[5-6]等方面取得了很大的研究進(jìn)展。然而，甲基兒茶素的天然資源十分有限，只有極少數(shù)的茶樹(shù)品種中的甲基兒茶素含量在1%以上[7-9]，加之由化學(xué)合成途徑獲得甲基兒茶素相對(duì)困難。因此，為了開(kāi)發(fā)利用這種天然功能成分，甲基兒茶素的酶學(xué)合成更具有重要的研究意義[10-11]。

在酶學(xué)合成方面，筆者所在的研究團(tuán)隊(duì)在前期的研究過(guò)程中，首先研究了重組大腸桿菌內(nèi)EGCG-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(EOMT)的誘導(dǎo)表達(dá)條件[12]；繼而分析推斷出EGCG-O-甲基轉(zhuǎn)移酶催化EGCG后生成的不同類(lèi)型的EGCG甲基化衍生物[13]；并查明了甲基化衍生物酶促合成的反應(yīng)條件[14]；但在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，EGCG-O-甲基轉(zhuǎn)移酶粗酶液的比活力很低，致使甲基化兒茶素的得率也比較低；因此，十分有必要對(duì)該酶進(jìn)行分離純化從而提高其催化活性。

本研究擬在上述研究基礎(chǔ)之上，進(jìn)一步開(kāi)展EGCG-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的分離純化研究，并查明其酶學(xué)特性，以期獲得純度較高、活性較強(qiáng)的EGCG-O-甲基轉(zhuǎn)移酶。該結(jié)果將有助于研究甲基化EGCG的酶學(xué)合成技術(shù)從而實(shí)現(xiàn)后續(xù)較大規(guī)模的甲基化兒茶素的酶法制備，也有助于進(jìn)一步研制開(kāi)發(fā)甲基兒茶素相關(guān)的新型功能食品和天然藥物等。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

基因重組茶樹(shù)EGCG-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的大腸桿菌工程菌由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保存[12]。宿主菌(感受態(tài)細(xì)胞)E.coli BL21(DE3)購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

鎳離子螯合柱(HisTMTrapHP) 美國(guó)GE Healthcare Bio-Science AB公司；蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 美國(guó)Bio-Rad公司；Bug Buster Master Mix菌體裂解液 美國(guó)Novagen公司；咪唑、牛血清白蛋白、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG，純度≥98%)、氨芐青霉素(Amp)、瓊脂粉 阿拉丁試劑(上海)有限公司；S-腺苷-甲硫氨酸對(duì)甲苯磺酸鹽(SAM)、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG) 美國(guó)Sigma公司；蛋白胨、酵母提取物 英國(guó)Oxoid公司。

Waters 2489-2690高效液相色譜儀 美國(guó)Waters公司；Buchi R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士Buchi公司；BS-1E振蕩培養(yǎng)箱 金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠(chǎng)；Eppendorf 5810R冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 重組茶樹(shù)EGCG-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的制備

1)取1μL重組質(zhì)粒加入剛剛?cè)诨谋磉_(dá)感受態(tài)細(xì)胞BL(21)DE3中，輕輕混勻，冰上孵育30min；42℃熱激1min，置于冰上3～5min后均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基(Amp+)上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。2)從平板中挑取單克隆于100mL液體培養(yǎng)基中，在37℃、200r/min培養(yǎng)約5～7h，使菌液生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期；按1%的接種比例接種于新的10瓶500mL LB液體培養(yǎng)基，繼續(xù)37℃、200r/min培養(yǎng)至菌液生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)前期約4h；加入IPTG溶液使其終濃度達(dá)到50mmol/L，20℃、150r/min培養(yǎng)誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。3)將過(guò)夜誘導(dǎo)的菌液于4℃、5000r/min離心收集菌體；將得到的約20g菌體保存于－80℃冰箱；4)取10g菌體，用50mL磷酸緩沖液混勻，－20℃冷凍1h，超聲溶解菌體，如此反復(fù)3次后于4℃，5000r/min離心10min，收集上清液作為粗酶液用于純化。

1.2.2 重組茶樹(shù)EGCG-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的純化

1)將粗酶液用注射器通過(guò)0.45μm濾膜，除去其中的菌體殘骸及其他雜質(zhì)。2)蛋白層析柱用純水清洗5個(gè)體積，而后再用磷酸緩沖液平衡5個(gè)體積。3)上樣，攪拌均勻，放置4h(期間0.5h攪拌一次)。4)采用梯度法開(kāi)始洗脫，咪唑濃度分別為0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500mmol/L，并將沒(méi)有結(jié)合的蛋白丟棄。5)收集各個(gè)濃度咪唑洗脫液所得。6)對(duì)收集的各管洗脫液進(jìn)行A280nm比色，以磷酸緩沖液做空白，保留吸光度大于零的洗脫液。7)對(duì)A280nm的各洗脫液組分進(jìn)行SDS-PAGE電泳，確定目的蛋白的位置和洗脫液咪唑濃度。8)將較純的目的蛋白各組分合并，繼而用磷酸緩沖液透析以除去咪唑。

1.2.3 蛋白分子質(zhì)量和濃度的測(cè)定

采用Laemmli法進(jìn)行SDS-PAGE測(cè)定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量；采用Lowry法，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。

1.2.4 酶活力測(cè)定

取1mL酶液加入15mL反應(yīng)液(含2mmol/L MgCl2和DTT、0.4mmol/L SAM、0.3mmol/L EGCG)，于35℃水浴中反應(yīng)1h，加入0.2mL 1mol/L鹽酸終止反應(yīng)。加入25mL乙酸乙酯萃取離心，取乙酸乙酯層真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮干燥后，用1.0mL水溶出，再加入0.5mL水潤(rùn)洗后混勻，HPLC檢測(cè)甲基化兒茶素的生成量，以此生成量表示酶活力。1個(gè)酶活力單位是指在35℃反應(yīng)條件下，1min內(nèi)甲基供體SAM向底物EGCG轉(zhuǎn)移1μmol甲基(－CH3)所需的酶量。

HPLC分析條件參照文獻(xiàn)[14-15]進(jìn)行。色譜柱：Waters Sunfire C18(4.6mm×250mm，5μm)；流動(dòng)相A為2%冰乙酸，流動(dòng)相B為乙腈，流速為1mL/min，柱溫40℃，檢測(cè)波長(zhǎng)280nm，進(jìn)樣量10μL，梯度洗脫，流動(dòng)相B在25min內(nèi)由12%線(xiàn)性梯度變化到25%，25.5min回到初始狀態(tài)，平衡10min。

1.2.5 重組茶樹(shù)EGCG-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定

1.2.5.1 最適反應(yīng)溫度

在pH7.5時(shí)，測(cè)定不同反應(yīng)溫度(25、30、35、40、45、50℃)條件下EGCG-O-甲基轉(zhuǎn)移酶活力，確定其最適反應(yīng)溫度。

1.2.5.2 最適反應(yīng)pH值

在溫度為35℃時(shí)，測(cè)定不同pH值(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)條件下EGCG-O-甲基轉(zhuǎn)移酶活力，確定其最適反應(yīng)pH值。

1.2.5.3 酶的動(dòng)力學(xué)常數(shù)

在最適反應(yīng)溫度和最適pH值條件下，以EGCG為底物，分析測(cè)定EGCG-O-轉(zhuǎn)移酶的動(dòng)力學(xué)常數(shù)；用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法繪出1/[V]-1/[S]直線(xiàn)，其斜率是Km/Vmax，在縱軸上的截距為1/Vmax，橫軸上的截距為－1/Km。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組茶樹(shù)EGCG-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的鎳離子螯合柱親和純化

由圖1可知，當(dāng)洗脫液中的咪唑濃度為10～30mmol/L時(shí)，有部分雜質(zhì)蛋白被洗脫下來(lái)，說(shuō)明在純化的起始過(guò)程中，可先用濃度為30mmol/L的咪唑洗脫液去除大腸桿菌體內(nèi)以及反應(yīng)體系中可能存在的一些原有的雜蛋白；當(dāng)洗脫液中的咪唑濃度為40～90mmol/L時(shí)，無(wú)蛋白質(zhì)被洗脫出來(lái)，說(shuō)明大部分雜蛋白可能已洗脫干凈；當(dāng)洗脫液中咪唑濃度大于100mmol/L時(shí)，目的蛋白開(kāi)始被洗脫出來(lái)，當(dāng)咪唑濃度為200mmol/L時(shí)，目的蛋白被大量洗脫出來(lái)；此外，當(dāng)洗脫液中咪唑濃度為300～500mmol/L時(shí)也有少量的目的蛋白被洗脫出來(lái)。可見(jiàn)，在純化EGCG-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的過(guò)程中，可采用梯度洗脫的方法進(jìn)行洗脫。100～300mmol/L咪唑?qū)?yīng)的泳道中雜蛋白含量已經(jīng)很少(箭頭所示為目的蛋白)，說(shuō)明此濃度范圍純化效果較好，可獲得高純度的EGCG-O-甲基轉(zhuǎn)移酶；經(jīng)分析檢測(cè)，酶的純度超過(guò)95%，分子質(zhì)量約為27.6kD。

圖 1 0～500mmol/L的咪唑洗脫蛋白的SDA-PAGE圖譜Fig.1 SDS-PAGE analysis of protein eluted by PBS with 0 — 500 mmol/L imidazole

表 1 重組茶樹(shù)EGCG-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的純化結(jié)果Table 1 Summary of purification of recombinant tea EGCG-Otransferase

重組茶樹(shù)EGCG-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的純化結(jié)果見(jiàn)表1，采用鎳離子親和層析可以實(shí)現(xiàn)對(duì)重組茶樹(shù)EGCG-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的快速純化，得到純度較高的EGCG-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的酶蛋白。

2.2 重組茶樹(shù)EGCG-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.2.1 最適反應(yīng)溫度

分別測(cè)定重組茶樹(shù)EGCG-O-甲基轉(zhuǎn)移酶在25～50℃條件下的酶活力，考察EGCG-O-甲基轉(zhuǎn)移酶催化反應(yīng)的最佳溫度。以酶活力最高值為100%，對(duì)不同溫度作圖，結(jié)果見(jiàn)圖2。EGCG-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的最適反應(yīng)溫度在35℃左右。

自發(fā)現(xiàn)O-甲基轉(zhuǎn)移酶以來(lái)，已從植物中直接分離純化或經(jīng)基因克隆獲得了多種O-甲基轉(zhuǎn)移酶，通過(guò)研究其酶學(xué)性質(zhì)發(fā)現(xiàn)O-甲基轉(zhuǎn)移酶的最適反應(yīng)溫度在35℃左右，最適pH值在6.5～8.0之間。比如Noriko等[16]從荷蘭鳶尾中克隆表達(dá)的2種咖啡酸-O-甲基轉(zhuǎn)移酶，并發(fā)現(xiàn)其最適溫度為35℃，最適pH值為7.5～8.0；Wang等[17]研究表明仙女扇(Clarkia breweri)中的丁香酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶最適溫度為35℃，最適pH值為7.5。

圖 2 溫度對(duì)EGCG-O-甲基轉(zhuǎn)移酶活力的影響Fig.2 Effect of temperature on tea EGCG-O-transferase activity

2.2.2 最適反應(yīng)pH值

預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)緩沖液pH值小于6.0時(shí)，向反應(yīng)體系中加入EGCG-O-甲基轉(zhuǎn)移酶后，反應(yīng)體系會(huì)迅速變渾濁，經(jīng)HPLC檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)任何新物質(zhì)生成，這表明當(dāng)pH值小于6.0時(shí)，EGCG-O-甲基轉(zhuǎn)移酶會(huì)發(fā)生失活。實(shí)驗(yàn)分別測(cè)定重組茶樹(shù)EGCG-O-甲基轉(zhuǎn)移酶在pH6.0～8.5條件下的酶活力，考察EGCG-O-甲基轉(zhuǎn)移酶催化反應(yīng)的最適pH值。以酶活力最高值為100%，對(duì)不同 pH值作圖，結(jié)果見(jiàn)圖3。該酶的最適反應(yīng)pH值為7.5。此結(jié)果與Noriko[16]、Wang[17]等的研究結(jié)果基本一致。

圖 3 pH值對(duì)EGCG-O-甲基轉(zhuǎn)移酶活力的影響Fig.3 Effect of pH on tea EGCG-O-transferase activity

2.2.3 酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)的確定

在最適反應(yīng)溫度35℃和最適pH 7.5條件下，以EGCG作為底物，測(cè)定酶反應(yīng)的反應(yīng)速率，用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法作圖。由圖4可知，其回歸方程為：y = 0.0134x +0.1336(R2=0.9943)， EGCG-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的Km值為0.100mmol/L，Vmax為7.485mg/(L·min)。Km值的大小表示酶對(duì)底物親合力的大小，Km越小表明酶對(duì)底物的親合力越強(qiáng)。

圖 4 雙倒數(shù)法測(cè)定EGCG-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的米氏常數(shù)Fig.4 Km determination of tea EGCG-O-transferase by doublereciprocal plot

3 結(jié) 論

重組茶樹(shù)EGCG-O-甲基轉(zhuǎn)移酶經(jīng)過(guò)HisTMTrap親和層析純化后，可得到純度超過(guò)95%的重組融合蛋白，純化倍數(shù)為22.51倍，酶活回收率為34.54%，酶比活力達(dá)到0.0186U/mg，酶分子質(zhì)量約為27.6kD。

酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定結(jié)果表明，該酶的最適反應(yīng)溫度為3 5 ℃，最適p H 值為7.5；以EGCG作為反應(yīng)底物，得到Lineweaver-Burk雙倒數(shù)線(xiàn)性回歸方程為y= 0.0134x+0.1336(R2=0.9943)，Km為0.100mmol/L，Vmax為7.485mg/(L·min)。

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