張名愛，王寶維,*，岳 斌，荊麗珍,3，葛文華

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266109；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)優(yōu)質(zhì)水禽研究所，山東 青島 266109；3.海陽(yáng)市畜牧獸醫(yī)站，山東 煙臺(tái) 265100)

酶的分離純化是研究酶的結(jié)構(gòu)、功能乃至認(rèn)識(shí)酶的分子本質(zhì)的前提。微生物產(chǎn)生的果膠酶多為胞外酶，得到酶粗提物后，分離純化的第一步就是根據(jù)酶蛋白質(zhì)溶解度性質(zhì)，采用中性鹽鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法、等電點(diǎn)沉淀法或者聚乙二醇沉淀法等將目的蛋白沉淀出來。多數(shù)果膠酶分離純化是以硫酸銨分級(jí)沉淀作為首選的粗提純方法。進(jìn)一步的純化通常根據(jù)目的酶的分子質(zhì)量大小、電荷性質(zhì)、親和專一性等，采用凝膠層析、離子交換、親和層析等諸多方法。目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)動(dòng)物源果膠酶生產(chǎn)菌株未見報(bào)道，尤其是有關(guān)鵝源草酸青霉產(chǎn)果膠酶特性的研究尚處于空白；對(duì)于果膠酶不同組分的分離純化，國(guó)內(nèi)外的報(bào)道主要集中于聚半乳糖醛酸酶(PG)組分[1-2]，尚未見有關(guān)動(dòng)物源草酸青霉產(chǎn)果膠酶分離純化工藝的研究。本實(shí)驗(yàn)對(duì)鵝源草酸青霉產(chǎn)果膠酶主要組分PG和果膠酯酶(PE)進(jìn)行分離純化，并進(jìn)行相關(guān)酶學(xué)性質(zhì)研究，旨在探索出高效、簡(jiǎn)單和低耗的新型果膠酶純化工藝。此外，本實(shí)驗(yàn)所使用的果膠酶產(chǎn)生菌來自家禽體內(nèi)，更能有效地適應(yīng)動(dòng)物體內(nèi)環(huán)境，能耐動(dòng)物腸道內(nèi)pH值，且能在動(dòng)物體內(nèi)定殖，為研發(fā)新型酶制劑提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實(shí)驗(yàn)所用菌株是由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)優(yōu)質(zhì)研究所首次從鵝盲腸中分離篩選得到[3]。該菌經(jīng)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所實(shí)驗(yàn)室鑒定，為草酸青霉(Penicillium oxalicum Currie &Thom)，微生物保藏號(hào)為CGMCC NO.2260。

硫酸銨 北京康普匯維科技有限公司；Sephacryl S-200凝膠 上海嶸崴達(dá)實(shí)業(yè)有限公司；DEAE葡聚糖凝膠、十二烷基硫酸鈉(SDS) 上海雅吉生物科技有限公司；低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白 Fermentas中國(guó)公司；丙烯酰胺 上海源葉生物科技有限公司；雙丙烯酰胺 北京中諾泰安科技有限公司；N,N,N,N’-四甲基乙二胺(TEMED) 上海億欣生物試劑公司；過硫酸銨(Ap) 上海將來試劑有限公司；β-巰基乙醇(β-ME) 上海艾研生物科技有限公司；BSA試劑盒 上海陽(yáng)光試劑有限公司。所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

MDF-U5411超低溫冰箱 日本三洋公司；BC-163 BD-93D冰箱 青島海爾電冰箱股份公司；TGL-16G高速冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；SL-2數(shù)控層析冷柜 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠；BS-100A自動(dòng)部分收集器 上海滬西分析儀器廠；BT00-50M蠕動(dòng)泵 保定蘭格恒流泵有限公司；LGJ-3冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；BS-1601核酸蛋白分析儀 日本島津公司；12C電泳儀 北京市六一儀器廠；移液器 德國(guó)Eppendorf公司；AR2140電子天平 美國(guó)奧豪斯公司；LX-C35L立式壓力蒸汽滅菌鍋 合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 果膠酶的分離純化

由從鵝腸道分離的草酸青霉為生產(chǎn)菌株，在最適培養(yǎng)條件下[4]發(fā)酵得到目的產(chǎn)物，以滅菌生理鹽水浸提45min，得到發(fā)酵液。將發(fā)酵液進(jìn)行硫酸銨鹽析，將粗酶液脫鹽濃縮，采用Sephacryl S-200分子篩初級(jí)分離和DEAE-Sephadex離子交換層析分離純化得到果膠酶，對(duì)目的產(chǎn)物進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定和酶學(xué)性質(zhì)研究。

1.3.2 純化物的鑒定

以SDS-PAGE方法鑒定純化物。

1.3.3 純化

1.3.3.1 (NH4)2SO4分級(jí)沉淀

將粗酶液于4℃、10000r/min離心30min去除固形物，向酶液中加入(NH4)2SO4并進(jìn)行有規(guī)則攪拌，4℃放置24h，觀察并測(cè)定上清液中PG和PE活力。(NH4)2SO4飽和度為20%～100%。

1.3.3.2 PG、PE的分子篩層析

分別經(jīng)飽和度60%～100% (NH4)2SO4沉淀、脫鹽、濃縮初步純化的粗酶液用Sephacryl S-200分子篩柱(1.6cm×70cm)分離純化，每次上樣量2mL。分別采用pH5.2和pH5.0的0.04mo1/L Na2HPO4-0.02mo1/L檸檬酸緩沖液洗脫，流速1.5mL/min。

1.3.3.3 PG、PE組分DEAE-Sephadex A-50離子交換洗脫pH值的選擇

根據(jù)Test-tube方法[5]確定DEAE-Sephadex A-50離子交換洗脫液的pH值。

1.3.3.4 PG、PE組分DEAE-Sephadex A-50離子交換洗脫

用透析袋和聚乙二醇20000濃縮，將透析袋一端密封后，裝入100mL原液，另一端也密封，用聚乙二醇20000濃縮，收集濃縮液，分別用pH6.5和pH5.0的0.04mo1/L Na2HPO4-0.02mo1/L檸檬酸緩沖液透析，并分別用pH6.5和pH5.0的0.04mo1/L Na2HPO4-0.02mo1/L檸檬酸緩沖液和0～1mo1/L NaCl線性梯度洗脫，在280nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，收集含蛋白部分。測(cè)定各管酶活力，收集酶活性部分洗脫液，然后進(jìn)行真空冷凍濃縮處理。洗脫部分測(cè)定酶活力后收集活性部分，測(cè)定蛋白濃度，最后通過不連續(xù)SDS-PAGE凝膠電泳，對(duì)純化物進(jìn)行鑒定。

1.3.3.5 PG、PE組分酶學(xué)性質(zhì)研究

在pH2.0～8.0的0.2mo1/L Na2HPO4-0.lmol/L檸檬酸緩沖液中進(jìn)行酶促反應(yīng)，測(cè)定不同條件下PG、PE的酶活力；在最適反應(yīng)pH值的0.2mo1/L Na2HPO4-0.lmol/L檸檬酸緩沖體系中，PG、PE酶液分別與0.01g/mL果膠溶液在35～65℃溫度條件下進(jìn)行酶促反應(yīng)；采用pH2.0～8.0經(jīng)0.2mo1/L Na2HPO4-0.lmol/L檸檬酸緩沖液處理純化后的PG、PE酶液，在4℃低溫條件下靜置4h，調(diào)節(jié)pH值至5.0后測(cè)定酶活力；將酶液置于30、40、50、60、70℃溫度條件下的水浴中保溫處理，每隔15min取2mL酶液，立即置于冰浴中冷卻，測(cè)定PG和PE的殘余酶活力。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用SAS統(tǒng)計(jì)軟件建立數(shù)據(jù)庫(kù)并處理數(shù)據(jù)。結(jié)果組間差異用One way ANOVA檢驗(yàn)，兩組間差異采用LSD法進(jìn)行多重比較，數(shù)據(jù)以±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 (NH4)2SO4分級(jí)沉淀預(yù)實(shí)驗(yàn)

圖 1 (NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)PG、PE組分沉淀的影響Fig.1 Effect of ammonium sulfate concentration on precipitation of PG and PE

由圖1可知，粗酶中PG、PE的(NH4)2SO4分級(jí)沉淀質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為60%～100%、70%～100%。

2.2 PG、PE的分子篩層析

圖 2 PG、PE組分 Sephacryl S-200分子篩層析洗脫曲線Fig.2 Elution profi le of PG and PE on Sephacryl S-200 fi ltration chromatography

由圖2可知，PG組分初步分離粗提物出現(xiàn)了3個(gè)主要的蛋白峰，第2、3兩個(gè)蛋白峰峰尖之間，經(jīng)測(cè)定有PG活力，收集各管洗脫液為目的蛋白所在的洗脫液；PE組分初步分離粗提物出現(xiàn)了2個(gè)主要的蛋白峰，第2個(gè)蛋白峰經(jīng)測(cè)定有PE活力，收集各管洗脫液為目的蛋白所在的洗脫液。

2.3 PG、PE組分DEAE-Sephadex A-50離子交換洗脫pH值的選擇

圖 3 PG、PE組分DEAE-Sephadex A-50離子交換洗脫pH值的確定Fig.3 pH selection of elution buffer for PG and PE on DEAE-Sephadex A-50

由圖3可知，采用不同pH值離子交換洗脫液進(jìn)行洗脫，上清液酶活力呈逐漸下降趨勢(shì)，當(dāng)酶活力達(dá)到最低時(shí)的pH值洗脫液為最佳pH值。pH6.5時(shí)，上清液中只含有少量PG酶活力，故選擇pH6.5的緩沖體系作為PG組分DEAE-Sephadex A-50離子交換洗脫純化所用的洗脫液；pH5.0時(shí)，上清液中只含有少量PE酶活力，故選擇pH5.0的緩沖體系作為PE組分DEAE-Sephadex A-50離子交換洗脫純化所用的洗脫液。

2.4 PG、PE組分DEAE-Sephadex A-50離子交換洗脫

圖 4 PG、PE組分DEAE-Sephadex A-50離子交換洗脫Fig.4 Elution profi le of PG and PE on DEAE-Sephadex A-50

由圖4可知，PG和PE組分均出現(xiàn)2個(gè)蛋白峰，說明用離子交換洗脫可以將不同酶組分分離，測(cè)定各管酶活力的最高者即為目的組分。經(jīng)酶活力測(cè)定，第2個(gè)蛋白峰有PG活力，第1個(gè)蛋白峰有PE活力。

2.5 蛋白得率及純化倍數(shù)

表 1 草酸青霉產(chǎn)聚半乳糖醛酸酶、果膠酯酶的分離純化結(jié)果Table 1 Purifification of PG and PE from Penicillium oxalicum

由表1可知，草酸青霉菌株發(fā)酵粗酶液中分離得到的PG和PE純酶，酶活回收率分別為50.97%和44.64%，純化倍數(shù)分別為32.21和23.98。由此可見，2種組分的純化倍數(shù)均較高。

2.6 SDS-PAGE電泳結(jié)果

圖 5 草酸青霉果膠酶PG(a)、PE(b)純化后SDS-PAGE電泳結(jié)果Fig.5 SDS-PAGE of purifi ed PG (a) and PE (b) from Penicillium oxalicum

將提純的PG、PE組分酶樣品和低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)為1條帶，均達(dá)到了電泳純。由圖5可知，PG、PE分子質(zhì)量分別為61.4、42.2kD。

2.7 PG、PE組分酶學(xué)性質(zhì)研究

2.7.1 pH值對(duì)PG、PE酶活力的影響

圖 6 pH值對(duì)PG、PE酶活力的影響Fig.6 Effect of pH on PG and PE activity

由圖6可知，2種組分酶活力隨著pH值的升高均呈先上升后下降的趨勢(shì)，且其受pH值影響顯著。當(dāng)pH值為5.0時(shí)，PG活力最高，為6282.35IU；與其他組相比，差異顯著(P＜0.05)或極顯著(P＜0.01)；在pH值為6.0時(shí)，PE活力達(dá)到最高，為8355.55 IU，因此PE的最適反應(yīng)pH值為6.0。

2.7.2 溫度對(duì)PG、PE活力的影響

圖 7 溫度對(duì)PG、PE酶活力的影響Fig.7 Effect of temperature on PG and PE activity

由圖7可知，隨著反應(yīng)溫度的升高PG和PE的酶活力均呈先上升后下降趨勢(shì)。在35～65℃溫度范圍內(nèi)，PG活力先隨溫度升高而增大，但溫度超過45℃后，PG活力又開始顯著下降(P＜0.05)。因此，PG的最適反應(yīng)溫度為40℃，此時(shí)PG活力達(dá)到5778.41IU；隨著溫度的升高，PE活力顯著上升(P＜0.05)，當(dāng)溫度為50℃時(shí)，PE活力最大，為5654.72IU；當(dāng)溫度超過50℃時(shí)，PE活力又開始下降。因此，PE的最適反應(yīng)溫度為50℃。

2.7.3 PG、PE的pH值穩(wěn)定性

圖 8 PG、PE的pH值穩(wěn)定性Fig.8 Effect of pH on PG and PE stability

由圖8可知，pH值在4.0～6.0范圍內(nèi)酶活力變化不顯著，PG酶活力能夠保持穩(wěn)定；但當(dāng)pH值超過7.0或低于4.0時(shí)，其酶活力顯著(P＜0.05)或極顯著下降(P＜0.01)。 pH值在2.0～5.0范圍內(nèi)，PE活力顯著或極顯著上升(P＜0.05或P＜0.01)；在pH5.0～7.0范圍內(nèi)，PE活力基本穩(wěn)定，并且顯著(P＜0.05)或極顯著(P＜0.01)高于其他pH值范圍；當(dāng)pH值超過7.0后，PE活力開始降低。

2.7.4 PG、PE的熱穩(wěn)定性

圖 9 PG、PE的熱穩(wěn)定性Fig.9 Effect of temperature on PG and PE stability

由圖9可知，純化后的PG隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活力逐漸下降。在30、40℃時(shí)，在0～105min范圍內(nèi)，各處理組之間酶活力差異不顯著；50～70℃之間，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，各組之間酶活力逐漸下降，且與對(duì)照組相比差異顯著(P＜0.05)或極顯著(P＜0.01)。純化后的PE在30℃時(shí)熱穩(wěn)定性較好，在0～105min以內(nèi)，各處理組之間酶活力變化差異不顯著；40℃處理時(shí)間少于60min，酶活力變化不明顯，而處理120min時(shí)仍能保持60%以上的活力；其他各組隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，PE活力顯著(P＜0.05)或極顯著下降(P＜0.01)。

3 討 論

3.1 層析介質(zhì)選擇對(duì)純化結(jié)果的影響

在對(duì)各種酶的性質(zhì)進(jìn)行研究時(shí)，為排除其他雜蛋白(酶)的影響，必須進(jìn)行分離提純。果膠酶分離提純的方法有多種，但大多數(shù)均采用離子交換柱層析和凝膠過濾相結(jié)合的方法[6-7]。近年來，研究者[8-9]根據(jù)果膠酶的底物專一性強(qiáng)的特點(diǎn)，采用疏水層析或親和層析的方法分離提純果膠酶也取得較好的效果。本實(shí)驗(yàn)從現(xiàn)有條件出發(fā)，根據(jù)已掌握的草酸青霉產(chǎn)果膠酶特性，采用(NH4)2SO4鹽析、透析袋脫鹽、PEG20000濃縮、DEAE-Sephadex A-50離子交換、Sephacryl S-200凝膠過濾等方法，分離提純草酸青霉產(chǎn)果膠酶中的PE和PG組分。

3.2 PE和PG最適作用溫度

低溫酶具有最適溫度低、在低溫條件下催化效率高、熱穩(wěn)定性差等特征。陳秀蘭等[10]報(bào)道的低溫酶的最適酶活溫度大部分為30～40℃，如Hamamoto等[11]報(bào)道Psedomonas fluorescens 114所產(chǎn)蛋白酶的最適溫度為30～40℃，Oh等[12]報(bào)道Azospirill屬所產(chǎn)酶的最適溫度為40℃。本實(shí)驗(yàn)分離菌株產(chǎn)生的PG最適反應(yīng)溫度為40℃，此溫度與動(dòng)物消化道溫度一致，能夠更好地促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，因此該酶比較適合作為飼料添加劑。PE在40℃時(shí)處理120min，仍能保持60%以上的活力，但PE最適作用溫度50℃比畜禽消化道內(nèi)的溫度高，難以達(dá)到最大的催化效力。因此應(yīng)對(duì)其進(jìn)行分子改性方面的研究，以期使其最適溫度與作用環(huán)境溫度一致。本實(shí)驗(yàn)酶學(xué)特性相關(guān)研究結(jié)果為該酶在飼料上的應(yīng)用以及進(jìn)一步的分子生物學(xué)研究提供一定的參考。

3.3 PE和PG最適作用pH值

PG最適作用pH值為5.0，pH值穩(wěn)定范圍為4.0～6.0，說明該酶有較好的酸穩(wěn)定性。湯鳴強(qiáng)[13]曾報(bào)道純化后黑曲霉PG的最適反應(yīng)pH值為3.0，pH值穩(wěn)定范圍為2.6～3.4?？梢?，本實(shí)驗(yàn)純化的PG組分具有與其有相似的酸堿穩(wěn)定性，而且更易在酸性環(huán)境條件下發(fā)揮作用。

3.4 純化結(jié)果的鑒定比較

從純化結(jié)果看，此純化方法是適用的。2個(gè)組分分別達(dá)到電泳純。PG、PE組分的純化倍數(shù)分別為32.21和23.98。PG分子質(zhì)量約為61.4kD，從國(guó)內(nèi)以往研究結(jié)果來看，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果大于文獻(xiàn)[9,14]報(bào)道的35、37、41.8kD，而又小于王紅梅等[15]所報(bào)道的80kD，這可能是由于PG組分的來源不同，導(dǎo)致PG分子質(zhì)量有所不同。PE分子質(zhì)量為42.2kD，該結(jié)果與Khanh等[16]報(bào)道的43kD一致。

4 結(jié) 論

鵝源草酸青霉果膠酶的PG和PE組分分子質(zhì)量分別為61.4、42.2kD，純化倍數(shù)分別為32.21和23.98。 PG酶活性最佳的pH值為5.0，反應(yīng)溫度為40℃，pH值穩(wěn)定范圍為4.0～6.0，在30、40℃時(shí)，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，各處理組之間酶活力基本保持不變；超過40℃后，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活力逐漸極顯著下降。PE酶活性最佳的pH值為6.0，反應(yīng)溫度為50℃，pH值穩(wěn)定范圍為5.0～7.0，在30℃時(shí)熱穩(wěn)定性較好。

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