陳 穎，肖辰鵬，陳曉云，楊麗維，唐 柳，李明春，張 峻,*

(1.天津市林業(yè)果樹(shù)研究所，天津 300384；2.南開(kāi)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300071)

固定化酶與游離酶相比具有穩(wěn)定性高、可重復(fù)使用、可連續(xù)操控、工藝簡(jiǎn)單等一系列優(yōu)點(diǎn)[1]。2000年荷蘭Delft理工大學(xué)的Sheldon小組提出了一種新型的無(wú)載體固定化酶方法—交聯(lián)酶聚集體(cross-linked enzyme aggregates，CLEAs)技術(shù)[2]。使用該方法所制備的固定化酶由酶蛋白和少量交聯(lián)劑組成，無(wú)惰性載體，具有酶活高、穩(wěn)定性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單、成本低廉等特點(diǎn)，是一種極具開(kāi)發(fā)前景的固定化酶方法[3]。

CLEAs的制備通常分為沉淀和交聯(lián)兩步，首先利用蛋白沉淀劑(如中性鹽、水溶性有機(jī)溶劑、非離子型高聚物等)將溶解狀態(tài)的酶進(jìn)行物理沉淀得到酶沉淀聚集體，隨后利用交聯(lián)劑(例如戊二醛)與酶聚集體分子上的氨基發(fā)生反應(yīng)，從而制得水不溶性顆粒[4]。沉淀?xiàng)l件及交聯(lián)條件均是決定CLEAs高酶活保留的關(guān)鍵因素。

海藻糖是由兩個(gè)葡萄糖分子以α-1,1糖苷鍵連接而成的非還原性雙糖，對(duì)生物膜和生物大分子具有良好的非特異性保護(hù)作用，在生物、醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域擁有廣闊的應(yīng)用前景[5]。海藻糖有多種合成途徑，而海藻糖合酶只需要一步反應(yīng)即可催化麥芽糖轉(zhuǎn)化為海藻糖，較其他合成途徑操作簡(jiǎn)單、成本低廉。然而，目前已報(bào)道的野生菌及工程菌產(chǎn)海藻糖合酶的水平均不高，為了解決這一問(wèn)題，人們開(kāi)展了酶的固定化研究。目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)海藻糖合酶的固定化研究?jī)H局限于載體固定化，載體固定化法由于載體在固定化酶中所占比例大，通常會(huì)影響底物和產(chǎn)物的擴(kuò)散，單位酶活低[6-8]；此外，一些載體穩(wěn)定性差或具有毒性，易污染產(chǎn)品。本實(shí)驗(yàn)采用交聯(lián)酶聚集體技術(shù)制備海藻糖合酶CLEAs，研究制備條件對(duì)CLEAs酶活的影響規(guī)律，并且考察了CLEAs的微觀結(jié)構(gòu)，比較了游離酶與CLEAs的部分酶學(xué)性質(zhì)。該研究對(duì)獲得性能優(yōu)異的無(wú)載體固定化海藻糖合酶從而利用固定化酶低成本制取海藻糖具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海藻糖合酶基因工程菌由課題組自主構(gòu)建[9]；海藻糖、麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Sigma公司；聚乙二醇8000(PEG8000) 北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司；正丙醇、異丙醇、丙酮 天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；25%戊二醛、乙醇、硫酸銨、氫氧化鈉等均為分析純 天津科威化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JYD智能型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 上海之信儀器有限公司；HZ9212S恒溫振蕩器 太倉(cāng)市科教器材廠；QUANTA200掃描電鏡 美國(guó)FEI公司；SW-CJ-2FD雙人單面凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；SORVALL ST16R高速冷凍離心機(jī) 賽默飛世爾科技有限公司；TU-1901雙光束紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司；Waters510高效液相色譜儀 美國(guó)Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 海藻糖合酶的制備

按照文獻(xiàn)[10]利用發(fā)酵罐對(duì)工程菌進(jìn)行高密度培養(yǎng)并誘導(dǎo)表達(dá)海藻糖合酶，離心收集菌體，用50mmol/L、pH7.0的磷酸緩沖液洗滌后配成菌懸液，進(jìn)行超聲處理，超聲功率200W，超聲5s，間隔5s，總超聲時(shí)間10min，所得處理液12000r/min離心15min，上清液以Ni-NTA瓊脂糖凝膠親和純化(純化酶液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，利用Quantity one v4.52軟件計(jì)算得到，海藻糖合酶純度約90%)，超濾濃縮后冷凍干燥，所得海藻糖合酶4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 海藻糖合酶的聚集沉淀

1.3.2.1 沉淀劑的選擇

用50mmol/L、pH7.0的磷酸緩沖液配制海藻糖合酶溶液，取1mL酶液，分別加入飽和硫酸銨、PEG8000、正丙醇、異丙醇、丙酮、無(wú)水乙醇6種試劑各9mL進(jìn)行聚集沉淀，定時(shí)取樣、離心，測(cè)定上清液蛋白含量，直至約90%的蛋白被沉淀，離心收集酶聚集體沉淀，將酶聚集體用磷酸緩沖液重溶后測(cè)酶活力，計(jì)算酶活回收率，酶活回收率為酶聚集體重溶后的酶活力與起始酶液酶活力的百分比。

1.3.2.2 PEG質(zhì)量濃度對(duì)沉淀效果的影響

取1mL酶液，加入PEG，分別使其終質(zhì)量濃度在10～50mg/mL，進(jìn)行聚集沉淀，將酶聚集體用磷酸緩沖液重溶后測(cè)酶活力，計(jì)算酶活回收率。

1.3.3 海藻糖合酶CLEAs的制備

于1mL一定質(zhì)量濃度的海藻糖合酶溶液中加入PEG至所需質(zhì)量濃度，振蕩混勻，形成酶聚集體懸液，然后加入一定量的體積分?jǐn)?shù)25%的戊二醛，150r/min交聯(lián)反應(yīng)一定時(shí)間后，3000r/min離心15min收集CLEAs，清洗，4℃保存。

1.3.4 硼氫化鈉處理對(duì)海藻糖合酶CLEAs酶活力的影響

海藻糖合酶CLEAs以5mL不同pH值緩沖液重懸后加入5mg或10mg硼氫化鈉分別處理30、60min后，離心、清洗、測(cè)酶活力。考察不同條件下硼氫化鈉處理對(duì)CLEAs酶活力的影響。將經(jīng)過(guò)硼氫化鈉處理后的CLEAs于60℃保溫18h后測(cè)殘存酶活力，考察硼氫化鈉處理對(duì)CLEAs熱穩(wěn)定性的影響。

1.3.5 海藻糖合酶及其CLEAs的部分酶學(xué)特性

1.3.5.1 最適反應(yīng)溫度與熱穩(wěn)定性

將海藻糖合酶及其CLEAs分別于40～80℃測(cè)定酶活力，以確定最適反應(yīng)溫度。將海藻糖合酶及其CLEAs分別于40～80℃條件下保溫120min，隨后立即取出測(cè)殘存酶活力，分析其熱穩(wěn)定性。

1.3.5.2 最適pH值與pH值穩(wěn)定性

將海藻糖合酶及其CLEAs分別于pH5.0～8.0的磷酸緩沖液中測(cè)酶活力，用以確定最適反應(yīng)pH值。取海藻糖合酶及其CLEAs分別溶于50mmol/L、pH3.0～4.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液；50mmol/L、pH5.0～8.0的磷酸緩沖液；50mmol/L、pH9.0～11.0的碳酸鈉-碳酸氫鈉的緩沖液中，于50℃保溫60min后按標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)酶活力，考察其pH值耐受性。

1.3.5.3 金屬離子對(duì)CLEAs活性的影響

于1mL的CLEAs懸浮液中分別加入終濃度為2mmol/L或10mmol/L的Zn2+、Cu2+、Al3+、Fe2+，于70℃反應(yīng)30min，測(cè)定生成的海藻糖含量，計(jì)算酶活力。以不加金屬離子的CLEAs懸浮液作為對(duì)照，來(lái)評(píng)估金屬離子對(duì)海藻糖合酶CLEAs酶活力的影響。

1.3.6 酶活力測(cè)定

取1mL游離海藻糖合酶溶液(或CLEAs懸浮液)，加入1mL質(zhì)量濃度為20mg/mL的麥芽糖溶液(以10mmol/L、pH6.5的磷酸緩沖液配制)，于50℃(CLEAs反應(yīng)溫度為70℃)保溫60min。離心，取上清液，用高效液相色譜法[11]測(cè)定生成的海藻糖含量。

酶活力單位定義為：在上述反應(yīng)條件下，每分鐘轉(zhuǎn)化1μmol底物所需的酶量定義為1U。

1.3.7 海藻糖合酶CLEAs的結(jié)構(gòu)特征

將制備所得的CLEAs凍干后進(jìn)行表面噴金處理，隨后利用QUANTA200型掃描電子顯微鏡對(duì)其微觀形貌進(jìn)行觀察，設(shè)置儀器加速電壓為15.0kV。

2 結(jié)果與分析

2.1 海藻糖合酶CLEAs制備條件的優(yōu)化

2.1.1 沉淀劑的選擇

酶聚集體的形成實(shí)質(zhì)上是將酶進(jìn)行濃縮沉淀，常用的沉淀劑有中性鹽類(lèi)、非離子聚合物、有機(jī)溶劑[12]。沉淀劑通過(guò)破壞蛋白分子表面帶電狀態(tài)或搶奪蛋白分子表面水膜使蛋白質(zhì)聚集沉淀，這一過(guò)程通常伴隨著蛋白分子內(nèi)非共價(jià)鍵(如氫鍵)的破壞，造成其空間結(jié)構(gòu)的變形，當(dāng)這種變形影響到酶分子的活性中心時(shí)，酶催化活性降低，表現(xiàn)為完全或部分失活，不同沉淀劑對(duì)酶分子三維結(jié)構(gòu)的影響不同，造成的失活程度也有所差異[13]。本實(shí)驗(yàn)采用飽和硫酸銨、終質(zhì)量濃度30mg/mL的PEG、異丙醇、正丙醇、丙酮、乙醇6種不同的沉淀劑進(jìn)行聚集沉淀，結(jié)果見(jiàn)表1。

表 1 幾種蛋白沉淀劑的比較Table 1 Comparison of several protein precipitants on activity recovery of trehalose synthase

由表1可知，以正丙醇、異丙醇、乙醇、丙酮有機(jī)溶劑為沉淀劑時(shí)，酶聚集體重新溶解后的酶活回收率只有20%左右，而以飽和硫酸銨為沉淀劑時(shí)，酶活回收率可達(dá)到66%，以PEG為沉淀劑時(shí)海藻糖合酶的酶活回收率最高，可達(dá)到95%，可見(jiàn)PEG為良好的海藻糖合酶沉淀劑。

圖 1 不同質(zhì)量濃度的PEG對(duì)海藻糖合酶CLEAs酶活回收率的影響Fig.1 Effect of PEG concentration on activity recovery of trehalose synthase aggregates

隨后進(jìn)一步研究了不同質(zhì)量濃度PEG的沉淀效果(圖1)，表明過(guò)低質(zhì)量濃度的PEG對(duì)酶的沉淀不完全，而當(dāng)PEG的質(zhì)量濃度≥25mg/mL時(shí)，CLEAs的酶活回收率均維持在90%以上，其中，采用質(zhì)量濃度為30mg/mL的PEG聚集沉淀海藻糖合酶的效果最好，酶活回收率可達(dá)到95%。

2.1.2 酶質(zhì)量濃度與交聯(lián)劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)所得海藻糖合酶CLEAs酶活力的影響

表 2 交聯(lián)條件對(duì)海藻糖合酶CLEAs的影響Table 2 Effect of free enzyme concentration as well as cross-linker concentration and dosage on activity recovery of trehalose synthase aggregates

交聯(lián)過(guò)程是通過(guò)雙功能試劑將酶的聚集體進(jìn)行共價(jià)捆綁，使酶的聚集體結(jié)構(gòu)和活性不被破壞，并可被回收使用[14]。常用的交聯(lián)劑是戊二醛。實(shí)驗(yàn)考察了不同體積分?jǐn)?shù)的戊二醛與酶質(zhì)量濃度對(duì)CLEAs交聯(lián)效果的影響。由表2可知，當(dāng)酶終質(zhì)量濃度相同時(shí)，戊二醛體積分?jǐn)?shù)越高，得到的海藻糖合酶CLEAs酶活力越低，例如，酶的終質(zhì)量濃度為5mg/mL時(shí)，加入體積分?jǐn)?shù)均為2%戊二醛制備得到的CLEAs的相對(duì)酶活力僅為0.5%戊二醛的56.3%。此外，當(dāng)戊二醛體積分?jǐn)?shù)相同時(shí)，如戊二醛體積分?jǐn)?shù)2%時(shí)，質(zhì)量濃度較高(20mg/mL)的酶交聯(lián)后得到的CLEAs的相對(duì)酶活力最高，而酶質(zhì)量濃度過(guò)低時(shí)交聯(lián)后的CLEAs酶活力相對(duì)較低；酶質(zhì)量濃度過(guò)高(如50mg/mL)時(shí)由于酶分子大量的聚集交聯(lián)，形成大團(tuán)簇的不規(guī)則CLEAs，影響了底物的傳質(zhì)過(guò)程，因而也造成了CLEAs酶活力的降低。當(dāng)加入每毫克酶添加的交聯(lián)劑體積相同時(shí)，低質(zhì)量濃度(5mg/mL)的酶交聯(lián)后得到的CLEAs酶活力相對(duì)較高。綜合考慮其他試劑的使用量，為降低成本，后續(xù)實(shí)驗(yàn)統(tǒng)一采用終質(zhì)量濃度為10mg/mL的海藻糖合酶。

2.1.3 交聯(lián)強(qiáng)度對(duì)所得海藻糖合酶CLEAs酶活力與熱穩(wěn)定性的影響

分別采用體積分?jǐn)?shù)為0.5%、1%、2%的戊二醛為交聯(lián)劑，對(duì)室溫交聯(lián)1、2、4、24h后得到的海藻糖合酶CLEAs進(jìn)行酶活力檢測(cè)(以酶活力最高值為100%)?？疾旖宦?lián)劑體積分?jǐn)?shù)與交聯(lián)時(shí)間對(duì)所得海藻糖合酶CLEAs的酶活影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。將上述不同條件所得CLEAs于60℃保溫2h，測(cè)殘存酶活力(以起始酶活力為100%)?？疾旖宦?lián)劑濃度與交聯(lián)時(shí)間對(duì)海藻糖合酶CLEAs熱穩(wěn)定性的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖2可知，交聯(lián)相同時(shí)間內(nèi)，CLEAs酶活隨交聯(lián)劑體積分?jǐn)?shù)的升高而逐漸下降，表明過(guò)度的交聯(lián)會(huì)導(dǎo)致酶活力的損失。從交聯(lián)時(shí)間對(duì)酶活力的影響來(lái)看，當(dāng)交聯(lián)劑體積分?jǐn)?shù)較低、交聯(lián)時(shí)間較短時(shí)(0.5%的戊二醛交聯(lián)1h)，部分酶蛋白可能未被交聯(lián)，未形成CLEAs，因此所得CLEAs的酶活力較低；隨著交聯(lián)時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活力達(dá)到最大，隨后又開(kāi)始下降；而當(dāng)交聯(lián)劑體積分?jǐn)?shù)較高(如2%)時(shí)，隨交聯(lián)時(shí)間的增加，所得CLEAs的酶活力則一直呈下降趨勢(shì)。

圖 2 交聯(lián)劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)海藻糖合酶CLEAs酶活力的影響Fig.2 Effects of cross-linker concentration and cross-linking time on relative activity of CLEAs

圖 3 交聯(lián)劑體積分?jǐn)?shù)及交聯(lián)時(shí)間對(duì)CLEAs熱穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effects of cross-linker concentration and cross-linking time on thermal stability of CLEAs

由圖3可知，隨著交聯(lián)劑體積分?jǐn)?shù)和(或)交聯(lián)時(shí)間的增加，所得CLEAs的熱穩(wěn)定性逐漸提高；但交聯(lián)強(qiáng)度超過(guò)一定限度時(shí)，例如交聯(lián)24h時(shí)，所得CLEAs的熱穩(wěn)定性變化不大。因此綜合考慮酶活和熱穩(wěn)定性兩個(gè)因素，本實(shí)驗(yàn)統(tǒng)一采用體積分?jǐn)?shù)為0.5%的交聯(lián)劑和2h的交聯(lián)時(shí)間。

2.1.4 硼氫化鈉還原處理對(duì)海藻糖合酶CLEAs性能的影響

戊二醛是有帶有兩個(gè)醛基的雙功能試劑，兩個(gè)對(duì)稱(chēng)的醛基與酶上的堿性氨基形成Schiff型加合物。而Schiff堿中的亞胺(C＝N)鍵不穩(wěn)定，硼氫化鈉可以將其還原成較穩(wěn)定的仲胺(C—N)鍵，使酶與戊二醛的結(jié)合更加牢固[15]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)硼氫化鈉處理的CLEAs酶活力及熱穩(wěn)定性進(jìn)行了考察，結(jié)果表明，在堿性環(huán)境下，經(jīng)硼氫化鈉處理后的CLEAs的酶活力和熱穩(wěn)定性均高于未經(jīng)處理的(表3)。經(jīng)過(guò)進(jìn)一步研究硼氫化鈉的濃度及處理時(shí)間后發(fā)現(xiàn)，在pH值為9.0的甘氨酸為緩沖液的條件下，添加5mg的硼氫化鈉處理30min，與處理60min后的相對(duì)酶活力及熱穩(wěn)定性差異均不大。表明5mg的硼氫化鈉經(jīng)短時(shí)間的處理后即可達(dá)到較好的效果。

表 3 硼氫化鈉處理對(duì)CLEAs酶活力及熱穩(wěn)定性的影響Table 3 Effect of NaBH4 treatment on relative activity and thermal stability of CLEAs

2.2 海藻糖合酶CLEAs的酶學(xué)性質(zhì)

2.2.1 最適催化溫度及溫度穩(wěn)定性

圖 4 溫度對(duì)CLEAs與游離酶酶活性的影響Fig.4 Effect of temperature on the activity of CLEAs and the free enzyme

圖 5 溫度對(duì)CLEAs與游離酶酶活性穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of temperature on the stability of CLEAs and the free enzyme

由圖4可知，游離酶的最適催化溫度為50℃，將其制備成CLEAs后最適催化溫度為70℃，最適催化溫度向高溫平移，表明海藻糖合酶CLEAs可在高溫下實(shí)現(xiàn)催化反應(yīng)。由圖5可知，海藻糖合酶在60℃保溫2h后的殘存酶活力＜20%。制備成CLEAs后在40～60℃范圍內(nèi)保溫2h后酶活力可保持90%以上，海藻糖合酶CLEAs的溫度穩(wěn)定性較游離酶明顯增寬。

2.2.2 最適反應(yīng)pH值及pH值穩(wěn)定性

由圖6可知，海藻糖合酶的最適催化pH值為6.5，制備成CLEAs后最適pH值變化不大，為7.0，較游離酶略向堿性偏移。游離海藻糖合酶在pH值為5.0～9.0時(shí)可保持90%以上的酶活力(圖7)，將其制備成CLEAs后pH值耐受范圍為5.0～10.0。而在pH值為4.0時(shí)CLEAs的殘存酶活力是游離酶的4倍左右，說(shuō)明CLEAs較游離酶更耐酸性。

圖 6 pH值對(duì)CLEAs與游離酶酶活性的影響Fig.6 Effect of pH on the activities of CLEAs and free enzyme

圖 7 pH值對(duì)CLEAs與游離酶酶活性穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effect of pH on the stability of CLEAs and the free enzyme

2.2.3 金屬離子的抑制作用

前期研究表明，在2mmo1/L或10mmol/L的Zn2+、Cu2+、Fe2+、Al3+作用下，游離海藻糖合酶的活性均受到強(qiáng)烈抑制，酶活力小于10%[16]。因此，本實(shí)驗(yàn)分別采用終濃度為2mmol/L和10mmol/L的Zn2+、Cu2+、Fe2+、Al3+金屬離子，測(cè)定其對(duì)海藻糖合酶CLEAs酶活力的影響。結(jié)果(圖8)表明，2mmol/L的Zn2+、Cu2+、Fe2+、Al3+對(duì)CLEAs酶活力的抑制不顯著，酶活力損失不到10%；當(dāng)Zn2+、Cu2+、Fe2+、Al3+金屬離子的濃度提高到10mmol/L時(shí)，對(duì)CLEAs的酶活力則有不同程度的抑制作用，其中10mmol/L的Cu2+對(duì)海藻糖合酶CLEAs的抑制作用最強(qiáng)，在其作用下CLEAs的相對(duì)酶活力為35%。

圖 8 金屬離子對(duì)CLEAs酶活性的影響Fig.8 Effect of metal ions on the activity of CLEAs

2.3 海藻糖合酶CLEAs的形貌特征

酶分子聚集的數(shù)量和方式對(duì)CLEAs的酶活具有重要的影響[17]。本實(shí)驗(yàn)利用電子顯微鏡對(duì)海藻糖合酶CLEAs的微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征。圖9中可清晰看到單個(gè)海藻糖合酶聚集體呈短棒狀(圖9C)，大小約在0.2～0.5μm，大量交叉相連的短棒以“腳手架”形式聚集形成一個(gè)集簇(圖9B)，而制備得到的海藻糖合酶CLEAs集簇的形狀不規(guī)則，粒徑差異較大，從幾微米到幾百微米(圖9A)。

圖 9 CLEAs電鏡圖像Fig.9 SEM images of CLEAs

3 結(jié) 論

采用無(wú)載體固定化技術(shù)制備了海藻糖合酶CLEAs，優(yōu)化了制備條件，分析了CLEAs的微觀結(jié)構(gòu)，比較了游離酶與CLEAs的反應(yīng)性能，得到如下結(jié)論：1)于10mg/mL的海藻糖合酶中加入終質(zhì)量濃度30mg/mL的PEG聚集沉淀后，以體積分?jǐn)?shù)為0.5%的戊二醛室溫交聯(lián)2h，再以硼氫化鈉處理后得到性能優(yōu)異的海藻糖合酶CLEAs；2)與游離海藻糖合酶相比，海藻糖合酶CLEAs的最適反應(yīng)pH值略有變化，由6.5左右升至7.0左右。而最適反應(yīng)溫度變化較大，由50℃升至70℃，更適于在較高溫度下使用；3)游離海藻糖合酶制成CLEAs后，對(duì)pH值、溫度的耐受性均得到增強(qiáng)，pH值穩(wěn)定范圍從5.0～9.0拓寬到5.0～10.0；60℃保溫120min后CLEAs仍可保持90%以上的活性，對(duì)Zn2+、Cu2+、Fe2+、Al3+金屬離子的抗性也明顯增強(qiáng)；4)微觀形貌分析可知，單個(gè)海藻糖合酶聚集體呈短棒狀，粒徑約0.2～0.5μm，眾多“短棒”交叉相連構(gòu)成“腳手架”狀集簇，集簇大小不一，粒徑從幾微米到幾百微米。

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