顧 欣，李 迪，侯雅坤，崔 潔，王建中,*

(1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083；2.林業(yè)食品加工與安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083；3.河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河北 石家莊 050026)

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin Ⅰ-converting enzyme，ACE)是腎素血管緊張素系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶，它能催化血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化成促血管收縮的血管緊張素Ⅱ，并且能使促進(jìn)血管擴(kuò)張的緩激肽失活[1]。ACE抑制劑的來源很多，最早的天然ACE抑制劑是從蛇毒液中發(fā)現(xiàn)的[2]。目前，食物源蛋白源的ACE抑制劑大致可以分為3類：動(dòng)物來源、發(fā)酵食品來源和植物來源。動(dòng)物蛋白源的ACE抑制劑主要由水產(chǎn)品蛋白和畜禽肌肉蛋白水解得到，如從沙丁魚[3]、金槍魚[4]、中國毛蝦[5]、鰹魚[6]、豬骨骼肌[7]水解物中都發(fā)現(xiàn)了具有新的氨基酸序列的ACE抑制肽。發(fā)酵食品來源的ACE抑制劑主要是通過乳酸菌發(fā)酵得到。Nakamura等[8]研究了發(fā)酵產(chǎn)品中發(fā)酵乳的抗高血壓效應(yīng)，該發(fā)酵乳是由常用的16種乳酸菌發(fā)酵制備而成。Nielsen等[9]發(fā)現(xiàn)來自于多種乳酸菌的蛋白酶水解乳蛋白也可釋放出ACE抑制肽，這些乳酸菌大部分用于發(fā)酵乳制品的生產(chǎn)。Saito等[10]從清酒和酒糟中分離出9種ACE抑制肽，并通過實(shí)驗(yàn)探索了肽的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。植物蛋白源來源廣泛，價(jià)格低廉，因此成為制備ACE抑制肽的較好選擇。早在1991年，Miyoshi等[11]就從天然α-玉米蛋白嗜熱菌蛋白酶水解物中分離出ACE抑制作用的短肽。植物蛋白源ACE抑制劑以豆類為來源的研究較多。以大豆多肽為例，張國勝等[12]以大豆分離蛋白為原料，選用4種蛋白酶對(duì)大豆蛋白進(jìn)行水解并比較水解產(chǎn)物對(duì)ACE的抑制效果，最終得到IC50值為0.846mg/mL的水解液。Shin等[13]從豆?jié){中分離一種三肽，并將該三肽連續(xù)注射SHR鼠，在多次注射后SHR鼠血壓明顯降低。許慧嬌等[14]僅研究出核桃蛋白酶解物有一定的抑制ACE作用并未行進(jìn)進(jìn)一步的分離純化。中國是核桃生產(chǎn)最大的國家，核桃制油后廢棄了大量的核桃渣，采用核桃渣為原料開發(fā)核桃蛋白肽，原料非常豐富，價(jià)格低廉。本研究希望能利用核桃粕，分離純化核桃蛋白水解物中的多肽，并通過體外測(cè)定ACE抑制活性的方法篩選，最終期望得到高活性的ACE抑制劑。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

核桃粕由河北晶果果業(yè)有限責(zé)任公司提供。

胃蛋白酶、馬尿酰組氨酰亮氨酸(Hip-His-Leu，HLL)、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)、Sephadex G-25葡聚糖凝膠 美國Sigma公司；乙腈、三氟乙酸、氫氧化鈉、鹽酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等均為國產(chǎn)分析純。

CXG-1電腦層析柜 上海滬西分析儀器廠有限公司；Sephadex G-25 Medium柱(1.6cm×60cm) 美國Pharmacia公司；PPSQ-31A全自動(dòng)蛋白/多肽序列儀 日本Shimadzu公司。

1.2 核桃蛋白的制備[15]

室溫下將核桃粕粉用石油醚浸泡脫脂，反復(fù)幾次至脫油徹底，置于通風(fēng)處晾干，過80目篩，得到脫脂核桃粉，真空包裝，于4℃條件下保存。

稱取一定質(zhì)量的脫脂核桃粕粉，加入適量去離子水，脫脂核桃粕粉與水液料比為12：1(V/m)，超聲細(xì)胞破碎處理30min。樣品溶液保持反應(yīng)體系溫度為65℃，用1mol/L NaOH溶液調(diào)至pH9.0，提取4h后，終止反應(yīng)，4000r/min離心20min，取上清液，用1mol/L HCl調(diào)節(jié)至等電點(diǎn)(PI)4.5進(jìn)行酸沉，靜置一段時(shí)間后，5000r/min離心15min，取沉淀，用去離子水洗沉淀至中性，迅速真空冷凍干燥，于－20℃保存。

1.3 核桃蛋白水解物的制備[16]

用胃蛋白酶對(duì)核桃蛋白進(jìn)行水解，水解條件為：將10g核桃蛋白粉溶于200mL去離子水中，配制成液料比為20：1(V/m)，用1mol/L HCl調(diào)至最適pH 3.0，加酶量為0.04g/g樣品，并維持反應(yīng)體系溫度55℃，水解時(shí)間4h。水解之后，樣品置于90℃水浴中滅酶30min。滅酶后將樣品離心(5000r/min、20min，4℃)，上清液調(diào)至pH7.0，冷凍干燥后于－20℃保存。

1.4 核桃蛋白水解物的分離純化

1.4.1 超濾

胃蛋白酶水解物在4℃條件下經(jīng)不同分子質(zhì)量大小的超濾膜(截留分子質(zhì)量：10000、5000D)獲得具有不同分子質(zhì)量的濾液，得到分子質(zhì)量大小范圍為0～5kD、5～10kD的濾液。將不同分子質(zhì)量范圍的濾液迅速真空冷凍干燥，并置于－20℃保存。

1.4.2 Sephadex G-25柱層析

具有高ACE抑制活性的凍干粉溶解在5mL 10mmol/L Tris-HCl(pH7.0，內(nèi)含150mmol/L NaCl)中，并經(jīng)脫氣及0.22μm膜過濾處理，然后經(jīng)CXG-1電腦層析柜進(jìn)行層析純化。流動(dòng)相為：10mmol/L Tris-HCl(pH7.0，內(nèi)含150mmol/L NaCl)。色譜柱條件：Sephadex G-25 Medium柱(1.6cm×60cm)，流速為1mL/min，整個(gè)設(shè)備系統(tǒng)在4℃條件下進(jìn)行。洗脫峰在280nm波長處進(jìn)行檢測(cè)并收集，其活性最高的組分收集液迅速進(jìn)行真空冷凍干燥，并置于－20℃保存。

1.4.3 SuperdexTMPeptide 10/300 GL柱分離

凝膠過濾分離：高ACE抑制活性的凍干粉用20mmol/L PBS(pH7.0)緩沖液溶解到1mL，并經(jīng)0.22μm微孔濾膜及脫氣處理，然后經(jīng)AKTA系統(tǒng)凝膠過濾純化。

流動(dòng)相為：20mmol/L PBS(pH7.0)。色譜柱條件：SuperdexTMPeptide 10/300 GL柱(10mm×300mm)，流速為0.5mL/min。洗脫峰在280nm波長處進(jìn)行檢測(cè)并收集，其ACE抑制活性最高的組分收集液迅速進(jìn)行冷凍干燥，并置于－20℃保存。

1.4.4 反相高效液相色譜(RP-HPLC)純化

將最高活性組分收集液的凍干粉，溶解于流動(dòng)相流動(dòng)相A(V(三氟乙酸)：V(水)為0.6：1)中，并經(jīng)脫氣過膜處理，然后經(jīng)反相高效液相色譜柱進(jìn)一步分離純化。色譜柱條件：Zorbax SB-C18柱(4.6mm×250mm)，流速為1.0mL/min。色譜柱先用流動(dòng)相A平衡15min，之后用流動(dòng)相B(0.05%三氟乙酸-乙腈)0～100%梯度洗脫，洗脫峰在波長214nm處進(jìn)行檢測(cè)，收集活性組分，冷凍干燥后，置于－20℃保存。

1.5 ACE抑制活性分析

ACE抑制劑活性測(cè)定[17]：色譜柱：C18柱(4.6mm× 250mm)；檢測(cè)波長：228nm；流動(dòng)相：V(甲醇)： V(水)=30：70，含體積分?jǐn)?shù)0.1%的三氟乙酸；流速：1mL/min。

將一定量的樣品溶于0.1mol/L、pH8.0、含0.3mol/L氯化鉀的硼酸鹽緩沖液(BBS)中，配制梯度質(zhì)量濃度的樣品溶液。取40μL樣品溶液和20μL 0.1U/mL ACE的BBS溶液置于37℃恒溫水浴中保溫10min，加入100μL 5mmol/L HHL BBS作為底物，37℃條件下反應(yīng)1h后加入50μL 1mol/L鹽酸中止反應(yīng)，冷卻至室溫，取20μL反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)樣，通過HPLC 洗脫圖譜定量馬尿酸生成量，以馬尿酸的生成量來判斷樣品的ACE抑制率。ACE抑制劑的IC50的計(jì)算采用侯亞坤[16]的方法。

式中：A1為空白對(duì)照組中馬尿酸的峰面積/(mAU·s)；A2為加入樣品組中馬尿酸的峰面積/(mAU·s)。

1.6 N端氨基酸測(cè)序

純化后的ACE抑制劑經(jīng)過埃德曼降解后，通過PPSQ-31A全自動(dòng)蛋白/多肽序列儀測(cè)定氨基酸序列。

1.7 體外模擬消化實(shí)驗(yàn)

純化后的ACE抑制肽的模擬消化實(shí)驗(yàn)，按李華等[18]的方法稍加更改：模擬胃液：0.075g胃蛋白酶溶于10mL 0.1mo/L HCl溶液中；模擬腸液：0.05g胰蛋白酶與0.3g?；撬崛苡?5mL 0.1mol/L NaHCO3溶液中。

純化后的ACE抑制劑配制成一定質(zhì)量濃度，取15mL于0.2mL模擬胃液混合，用1moL/L HCl調(diào)至pH2，于37℃條件下消化，6h后加入1mL模擬腸液用1mol/L NaHCO3調(diào)節(jié)pH7.8，于37℃繼續(xù)消化6h，反應(yīng)結(jié)束后調(diào)pH值為中性，用截留分子質(zhì)量1000D的超濾管離心(3000r/min、20min，4℃)除酶，所得濾液保存凍干并測(cè)定其ACE抑制率。

2 結(jié)果與分析

2.1 ACE抑制劑的分離純化

為了獲得核桃蛋白水解物，選取胃蛋白酶對(duì)其水解。以ACE抑制率作為分離篩選的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

胃蛋白酶按照所列出的條件對(duì)核桃蛋白進(jìn)行水解，水解后將所得樣品冷凍干燥，測(cè)定其(質(zhì)量濃度為1mg/mL)ACE抑制活性，結(jié)果為20.79%，顯示出胃蛋白酶水解物有一定的ACE抑制作用。Hyun等[19]研究發(fā)現(xiàn)，牛血清蛋白的蛋白酶水解物隨著超濾截留的分子質(zhì)量的減小，超濾物的ACE抑制活性逐漸升高。對(duì)胃蛋白酶水解液進(jìn)行分子質(zhì)量截留，超濾在4℃條件下進(jìn)行，經(jīng)過截留分子質(zhì)量10kD超濾膜，去除蛋白酶與雜質(zhì)，將濾液經(jīng)過5kD的截留，對(duì)所得組分(0～5kD、5～10kD)分別測(cè)定其ACE抑制效果。所得結(jié)果，胃蛋白酶水解物0～5kD組分ACE抑制活性(IC50值為40.00μg/mL)較5～10kD組分ACE抑制活性(IC50值為126.34μg/mL)效果明顯。對(duì)0～5kD組分進(jìn)一步進(jìn)行Sephadex G-25凝膠層析分離。具有ACE抑制劑活性的分子質(zhì)量低于5kD的凍干粉末，通過Sephadex G-25 Medium柱分離純化，洗脫峰在波長280nm處檢測(cè)并收集測(cè)定ACE抑制活性。分離結(jié)果見圖1，得到4個(gè)組分分別為P1、P2、P3、P4，各組分抑制ACE活性的IC50結(jié)果見圖2。比較各組分ACE抑制效果，其中P3的結(jié)果較突出，其IC50值為0.02mg/mL。

圖 1 胃蛋白酶水解物(0～5kD)活性組分經(jīng)Sephadex G-25分離譜圖Fig.1 Separation of active components from walnut protein pepsin hydrolysate by Sephadex G-25 chromatography

圖 2 Sephadex G-25分離后所得胃蛋白酶水解物活性組分ACE抑制活性的IC50Fig.2 IC50 of the active components obtained by Sephadex G-25 chromatography

取Sephadex G-25分離純化所得ACE抑制活性最高的P3組分，經(jīng)SuperdexTMPeptide 10/300 GL凝膠過濾色譜進(jìn)一步分離純化分離結(jié)果見圖3，得到3個(gè)組分P3-1、P3-2、P3-3，分別測(cè)定其ACE抑制活性，所得結(jié)果見圖4，P3-3組分的ACE抑制效果較為突出其IC50為0.39μg/mL。

圖 3 活性組分P3經(jīng)Superdex? Peptide 10/300柱分離譜圖Fig.3 Chromatography profi le showing the separation of active component 3 (P3) on Superdex? Peptide 10/300 column

圖 4 活性組分P3經(jīng)Superdex? Peptide 10/300柱分離后所得組分的ACE抑制活性的IC50Fig.4 IC50 of three fractions (P3-1, 2 and 3) of active component 3

圖 5 活性組分P3-3經(jīng)過反相高效液相色譜Zorbax SB-C18柱純化譜圖Fig.5 Chromatography profi le showing the separation of P3-3 on Zorbax SB-C18 column

將P3-3溶解于流動(dòng)相A中，利用反相高效液相色譜進(jìn)行純化，得到純度較高的組分，分離結(jié)果見圖5。測(cè)定其抑制ACE活性的IC50值為0.32μg/mL。

2.2 ACE抑制劑的結(jié)構(gòu)分析

純化后的ACE抑制劑的氨基酸序列為酪氨酸-谷氨酸-脯氨酸(YEP)，其理論分子質(zhì)量為407.43D。有研究表明天然的ACE抑制肽通常含有Pro、Lys以及一些芳香族氨基酸殘基[20]。

2.3 體外模擬消化實(shí)驗(yàn)

模擬了胃液以及腸液的消化環(huán)境，經(jīng)反相高效液相色譜純化所得ACE抑制劑進(jìn)行體外模擬消化實(shí)驗(yàn)。純化后的ACE抑制劑消化前后的ACE抑制活性基本保持不變(純化后的ACE抑制劑消化前ACE抑制的IC50值為0.32μg/mL，消化后ACE抑制的IC50值為0.36μg/mL)。結(jié)果表明，該抑制劑可以在體內(nèi)消化環(huán)境中保持良好的穩(wěn)定性及生物活性。

3 結(jié) 論

植物蛋白的天然成分對(duì)人類的疾病有著獨(dú)特的功效并且沒有人工合成藥物的副作用[20]，本實(shí)驗(yàn)選取核桃粕作為蛋白源，充分挖掘了核桃粕的升值內(nèi)涵，解決了生產(chǎn)中大部分核桃粕蛋白利用率偏低的問題。選擇內(nèi)肽酶進(jìn)行酶水解，其反應(yīng)條件溫，專一性強(qiáng)。胃蛋白酶為內(nèi)肽酶，有效的防止水解過程中產(chǎn)生過多的氨基酸[21]。在進(jìn)行分離純化的過程中，黃家音等[22]提出利用分離原理不同的多種手段結(jié)合，所得到的目的產(chǎn)物將更純。本研究采用超濾去除大分子蛋白和多肽、在凝膠過濾色譜Sephadex G-25和SuperdexTMPeptide 10/300基礎(chǔ)上，又進(jìn)行反相高校液相色譜純化，獲得IC50值為0.32μg/mL的高純度高活性的ACE抑制劑 YEP。模擬消化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該抑制劑在體內(nèi)不會(huì)被進(jìn)一步水解降低活性。ACE抑制劑可以通過合成的方式得到，利用合成的多肽，后期可以進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證其降血壓能力，以及其他生物活性的測(cè)定。

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