楊相宜，滿朝新，劉 穎，王今雨，郎 友，董鑫悅，閆天文，姜毓君,,*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院 乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學 國家乳業(yè)工程技術(shù)研究中心，黑龍江 哈爾濱 150086)

嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)是人體小腸內(nèi)的主要益生菌，具有調(diào)整腸道菌群平衡，抑制腸道不良微生物的增殖，增強免疫和延緩機體衰老等作用。嗜酸乳桿菌胞外多糖(EPS)是嗜酸乳桿菌在生長代謝過程中分泌到細胞壁外、易與菌體分離的水溶性多糖，屬于次級代謝產(chǎn)物。大量研究表明，胞外多糖安全無毒，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、降膽固醇和抗氧化等益生作用[1-2]，因此備受人們的關(guān)注?，F(xiàn)有研究表明，胞外多糖可以作為一種天然的食品添加劑，有效抑制有害微生物生長，并且對人體有益[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，嗜酸乳桿菌的免疫調(diào)節(jié)作用與其分泌的胞外多糖有很大的關(guān)系[4]。目前，對于胞外多糖的研究很多，但極少有人從宿主免疫相關(guān)基因角度入手分析胞外多糖對機體的免疫調(diào)節(jié)作用。由于CCL2和IL18在提高宿主免疫功能的過程中發(fā)揮著重要的作用，本實驗對嗜酸乳桿菌NCFM胞外多糖作用于小鼠腸組織后引起的CCL2和IL18基因的表達變化進行研究，為更深入了解嗜酸乳桿菌的生理功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

昆明系小鼠，體質(zhì)量平均為(20±2)g，購自黑龍江省醫(yī)科大學實驗動物中心。

嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)NCFM由丹麥丹尼斯克公司(Danisco)惠贈。

總RNA提取試劑Trizol Reagent 美國Invitrogen公司；Ex ScriptTMRT-PCR Kit、SYBR Premix Ex TapTMII 大連TaKaRa公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ABI7500實時熒光PCR儀 美國ABI公司；G1-21M冷凍離心機 上海市離心機械研究所；LGJ-1型冷凍干燥機 上海醫(yī)用分析儀器廠；DYY-10C型電泳儀 北京市六一儀器廠；UVP凝膠成像系統(tǒng) 美國UVP公司。

1.3 胞外多糖的提取

將實驗室保存的嗜酸乳桿菌NCFM活化后，按3%接種量接入MRS培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h后，8000r/min、4℃離心15min，取上清液。將上清液減壓濃縮至1/3體積，酶解后用Sevag法(氯仿、正丁醇體積比5：1)除蛋白。再經(jīng)過過氧化氫脫色、乙醇沉淀多糖、透析、凍干，得粗胞外多糖(EPS)粉末。將粗EPS溶于去離子水，經(jīng)DEAE-Sephadex離子交換柱純化，最后濃縮、透析、凍干得到一種白色纖維狀疏松固體，該物質(zhì)極易溶于水，水溶液顯酸性。用苯酚-硫酸法檢測所得物質(zhì)純度[5]。

1.4 構(gòu)建小鼠模型

本實驗采用昆明系小鼠(20±2)g，雌雄各半，自由采食，分為對照組(每天灌胃生理鹽水)、實驗組(灌胃劑量為100mg/(kg·d)胞外多糖)。連續(xù)灌胃14d，分別在0、1、4、7、10、14d處死小鼠，每個時間點每組10只，取胸腺和脾臟稱質(zhì)量，計算臟器系數(shù)[2]。取小鼠空腸和回腸，用Trizol法提取腸組織RNA，以瓊脂糖凝膠電泳檢測并測定其波長260nm和280nm處的光密度值，計算OD260nm/OD280nm比值，分析純度。

式中：md為臟器的絕對質(zhì)量(肝臟質(zhì)量+脾臟質(zhì)量)/mg；mb為小鼠體質(zhì)量/g。

1.5 Real-time RT- PCR驗證小鼠免疫相關(guān)基因

1.5.1 引物設(shè)計

在GenBank中查找出各基因的序列，使用Primer 5.0軟件對各差異表達基因進行跨內(nèi)含子設(shè)計引物，見表1，實驗利用GAPDH作為內(nèi)參基因，消除本底模板差異。

表 1 待測基因Real-time RT PCR引物的堿基序列、Tm值及擴增產(chǎn)物的大小Table 1 Base sequences and Tm of specific oligonucleotide primers for RT-PCR as well as the sizes of PCR products

1.5.2 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件

反轉(zhuǎn)錄條件：37℃、15min；85℃、5s。Real-time PCR反應(yīng)條件：95℃預變性10s；95℃變性5s，60℃退火34s，循環(huán)40次，20μL體系。

1.5.3 統(tǒng)計分析

將每個待測樣品均設(shè)3個重復，利用2 -ΔΔCt法對目的基因的相對表達量進行評價。所得數(shù)據(jù)利用SPSS 18.0軟件進行分析，采用單項方差分析法計算3次重復得到的相對定量的標準差，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 苯酚-硫酸法測胞外多糖含量

葡萄糖標準曲線y=0.9657x－0.018(R2=0.9955)，線性關(guān)系良好，可以用于計算胞外多糖純度。通過計算，胞外多糖純度為87.93%。將所得胞外多糖溶于Tris中，進行蛋白電泳測定，泳道無條帶(圖未附加)，表明無蛋白殘留，可用于后續(xù)實驗。

2.2 臟器系數(shù)

表 2 嗜酸乳桿菌NCFM胞外多糖對小鼠免疫臟器器官的影響Table 2 Effect of exopolysaccharide produced by Lactobacillus acidophilus NCFM on immune organs of mice

胸腺和脾臟是最重要的免疫器官，為了研究胞外多糖是否可以促進免疫器官發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，本實驗取小鼠胸腺和脾臟稱質(zhì)量，分析胞外多糖對其質(zhì)量變化的影響。由表2可知，隨著時間的延長，對照組的臟器系數(shù)略升高，實驗組的臟器系數(shù)明顯升高。且與對照組相比，實驗組可以顯著增加臟器的質(zhì)量(P＜0.05和P＜0.01)。說明嗜酸乳桿菌NCFM胞外多糖可以促進免疫器官質(zhì)量增加，進而起到促進免疫功能的作用。

2.3 小鼠免疫相關(guān)基因CCL2和IL18的驗證

2.3.1 RNA提取和純度檢測

測定所提取的總RNA的OD260nm、OD280nm值[6]，算得OD260nm/OD280nm均在1.8～2.2范圍內(nèi)(實驗組為2.01，對照組為2.07)，表明所提取的總RNA純度較高，沒有蛋白質(zhì)和DNA殘留。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，18S RNA和28S RNA電泳條帶清晰，5S RNA較暗，無明顯降解(圖1)。說明總RNA質(zhì)量完好，結(jié)果合格，可以進行Real-time RT- PCR實驗。

圖 1 總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of total RNA

2.3.2 Real-time PCR驗證

圖 2 Real-time RT PCR驗證的CCL2基因溶解曲線(a)和擴增曲線(b)Fig.2 Solubility(a) and amplification curves(b) of RT-PCR for CCL2 gene

本實驗室此前已經(jīng)通過嗜酸乳桿菌NCFM灌胃小鼠發(fā)現(xiàn)其能誘導免疫基因的表達。為進一步分析嗜酸乳桿菌NCFM所分泌胞外多糖對小鼠腸組織免疫相關(guān)基因表達的動態(tài)變化趨勢，利用嗜酸乳桿菌NCFM胞外多糖灌胃小鼠，分別在1、4、7、10、14d處死小鼠，提取腸組織，然后采用Real Time RT-PCR方法對免疫相關(guān)基因IL18和CCL2的表達進行檢測，并以管家基因GAPDH作為內(nèi)參基因[7]。

圖 3 Real-time RT PCR驗證的IL18基因溶解曲線(a)和擴增曲線(b)Fig.3 Solubility(a) and amplification curves(b) of RT-PCR for IL18 gene

圖 4 CCL2基因的相對表達量Fig.4 Relative expression of CCL2 gene

圖 5 IL18基因的相對表達量Fig.5 Relative expression of IL18 gene

圖2和圖3是基因CCL2和IL18的Real-time RT-PCR的溶解曲線和擴增曲線。由此可知，溶解曲線單一，擴增曲線呈現(xiàn)標準的S型，表明擴增效果良好，所得到的數(shù)據(jù)可以用于計算。圖4、5是灌胃小鼠14d，不同時間點處死小鼠，腸組織中免疫相關(guān)基因CCL2和IL18的表達量的變化情況。CCL2基因一直呈現(xiàn)上調(diào)表達，IL18基因除第1天下調(diào)表達外，其余時間點均呈現(xiàn)上調(diào)表達，且與對照組相比差異顯著。隨著時間的延長，CCL2和IL18基因的表達呈現(xiàn)出先迅速增加后減小的趨勢，且均在第4天達到最大值，與對照組相比，差異極顯著(P＜0.001)。說明嗜酸乳桿菌NCFM胞外多糖對免疫相關(guān)基因具有明顯的調(diào)控作用。

3 討 論

目前，已有很多學者研究多糖的益生作用，發(fā)現(xiàn)不同的多糖具有不同的免疫調(diào)節(jié)作用，對于生理功能的發(fā)揮起到了重要作用[8]。已有大量研究表明，乳酸菌的部分生理功能與其分泌的胞外多糖緊密相關(guān)[9]。對于胞外多糖的提取方法目前比較成熟，但由于某些小分子肽類、油脂和蛋白等物質(zhì)會與胞外多糖緊密結(jié)合，所以完全得到極高純度的胞外多糖尚沒有辦法完成，只能制備相對純度的胞外多糖。雖然如此，這些蛋白等雜質(zhì)卻并不會對胞外多糖與機體發(fā)揮免疫作用造成很大的影響，有些糖蛋白甚至會促進胞外多糖的活性[4,10-11]。實驗室前期已經(jīng)研究了嗜酸乳桿菌NCFM對Caco-2細胞免疫相關(guān)基因的調(diào)控，為了進一步研究嗜酸乳桿菌NCFM分泌物的重要作用，本實驗圍繞其所分泌的胞外多糖對小鼠腸組織的免疫相關(guān)基因的調(diào)節(jié)作用進行了研究。

白介素-18(IL-18)，又稱γ干擾素(IFN-γ)誘生因子，屬白介素-1家族，是一種誘導IFN-γ合成的中介分子，在機體的免疫調(diào)節(jié)中起著重要的作用。它能刺激T細胞增殖，增強自然殺傷細胞活性，參與細胞因子的生成等，與白介素-12產(chǎn)生協(xié)同作用[10]。趨化因子是一類能夠趨化細胞的遷移的小分子分泌蛋白，細胞沿著趨化因子濃度增加的信號向趨化因子源處的遷徙，有些趨化因子在免疫監(jiān)視過程中控制免疫細胞趨化。CCL2是趨化因子CC亞家族中的一員，能夠趨化和激活T淋巴細胞和單核細胞，使免疫細胞向病變部位聚集[12]，從而起到免疫調(diào)控作用。也有報道稱，CCL2可以通過抑制單核細胞，同時刺激IL4的分泌，進而抑制腫瘤免疫[13]。有研究表明IL18和CCL2 mRNA水平的提高都會伴隨著蛋白表達的提高，而且這些基因的表達也可以直接表明對DCs等免疫細胞具有影響。因此可以根據(jù)mRNA水平的變化間接反映蛋白水平的變化以及胞外多糖對相關(guān)免疫細胞的調(diào)節(jié)作用[14-17]。在本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)嗜酸乳桿菌NCFM胞外多糖可以使IL18和CCL2的表達量顯著升高，也可表明胞外多糖可以使IL18和CCL2的蛋白表達量上調(diào)，驗證了胞外多糖可以促進機體的免疫活性。

雖然免疫相關(guān)基因IL18和CCL2在機體免疫反應(yīng)中起到非常重要的作用，但是長期的表達會對機體造成過免疫過度，導致組織受損[18-19]。從本實驗的結(jié)果可知，CCL2和IL18隨著實驗時間的延長，表達量均趨向于未作用組的表達量(圖4、5)，表明嗜酸乳桿菌NCFM胞外多糖只是暫時性的誘導免疫相關(guān)基因的表達，這就使得胞外多糖既可以增強機體免疫功能，又不會引起免疫過度，造成機體損害。另外，CCL2和IL18的表達趨勢雖然相似，但第4天達到最大表達量的值卻相差甚遠。有研究表明，免疫相關(guān)基因的表達依賴于機體免疫信號通路[20]，添加信號通路抑制劑會導致免疫相關(guān)基因的表達量明顯下降[21-22]。CCL2和IL18通過不同信號通路進行表達，再加上CCL2和IL18與其他細胞因子的相互作用不同，這可能是導致它們的表達量出現(xiàn)偏差的原因。

綜上所述，嗜酸乳桿菌NCFM胞外多糖能夠增強機體的免疫反應(yīng)，具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用，為今后利用這種物質(zhì)開發(fā)新功能性食品提供了新的線索。

[1] PATEL A K, MICHAUD P, SINGHANIA R R. Polysaccharides from probiotics： new developments as food additives[J]. Food Technol Biotechnol, 2010, 48(4)： 451-463.

[2] 牟光慶, 李霞, 李瑤喜, 等. 乳酸菌胞外多糖增強小鼠免疫功能的研究[J]. 食品科學, 2009, 30(5)： 260-262.

[3] WU M H, PAN T M, WU Y J. Exopolysaccharide activities from probiotic bifidobacterium： immunomodulatory effects (on J774A.1 macrophages) and antimicrobial properties[J]. International Journal of Food Microbiology, 2010, 144： 104-110.

[4] 李偉欣, 陳倩, 李平蘭, 等. 一種雙歧桿菌胞外多糖免疫調(diào)節(jié)功能研究[J]. 微生物學通報, 2009, 36(6)： 931-935.

[5] 邢書涵, 連正興, 孫勇, 等. 藏靈菇源干酪乳桿菌KL1胞外多糖抑制人結(jié)腸癌細胞增殖的研究[J]. 食品科學, 2012, 33(7)： 284-288.

[6] 趙圣國, 王加啟, 張春剛, 等. 小鼠免疫刺激后乳腺plg rmRNA轉(zhuǎn)錄及乳特異性lgA含量的變化[J]. 華北農(nóng)學報, 2010, 25(6)： 19-24.

[7] 劉穎. 植物乳桿菌NDC75017對宿主免疫相關(guān)基因的調(diào)控及其作用機制研究[D]. 哈爾濱： 東北農(nóng)業(yè)大學, 2012.

[8] FOLIGNE B, DEUTSCH S M, BRETO J. Promising Immunomodulatory effects of selected strains of dairy propionibacteria as evidenced in vitro and in vivo[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2010, 76(24)： 8259-8264.

[9] MARTA C L, BERNADETA N, MA?GORZATA S. Immunoregulatory potential of exopolysaccharide from Lactobacillus rhamnosus KL37. Effects on the production of inflammatory mediators by mouse macrophages[J]. International Journal of Experimental Pathology, 2011, 92(12)： 382-391.

[10] CHABOT S, YU H L, LéSéLEUC L D. Exopolysaccharides from Lactobacillus rhamnosus RW-9595M stimulate TNF, IL-6 and IL-12 in human and mouse cultured immunocompetent cells, and IFN-γ in mouse splenocytes[J]. EDP Sciences, 2001, 81： 683-697.

[11] 張利平, 陳彥, 王子堯, 等. 羊肚菌胞外多糖免疫活性研究[J]. 中國食用菌, 2009, 28(3)： 47-49.

[12] 張聞宇, 黃文棟, 婁桂予. 膽汁酸G蛋白偶聯(lián)受體通過p38 MAPK 通路誘導巨噬細胞IL1β、TNF-α和IL6的轉(zhuǎn)錄[J]. 第三軍醫(yī)大學學報, 2012, 34(7)： 597-601.

[13] SHALLO H, PLACKETT T P, HEINRICH S A. Monocyt chemoattractant protein-1(MCP-1) and macrophage infitltration into the skin after bum injury in aged mice[J]. Burns, 2003, 29(7)： 641-647.

[14] MALLAT Z, CORBAZ A, ALEXANDER Y. Scoazecexpression of interleukin-18 in human atherosclerotic plaques and relation to plaque instability[J]. Circulation, 2001, 104： 1598-1603.

[15] JAMES A H, ALEXANDRA G, JENNIFER L W. Interleukin 18 coexpression during respiratory syncytial virus infection results in enhanced disease mediated by natural killer cells[J]. J Virology, 2010, 84(4)： 4073-4082.

[16] JENNIFER M L, LIANNE H, THUY T P. Coordination of early protective immunity to viral infection by regulatory T cells[J]. Science, 2008, 320： 1220-1224.

[17] KIRAN A, SCOTT P, SHOUKAT D. Role of epithelial integrinlinked kinase in promoting intestinal inflammation： effects on CCL2, fibronectin and the T cell repertoire[J]. BMC Immunology, 2011, 12： 42.

[18] HAN B, MURA M, ANDRADE C F, et al. TNF-α-induced long pentraxin PTX3 expression in human lung epithelial cells via jnk[J]. J Immunology, 2005, 175(12)： 8303-8311.

[19] PEDRO A R, HOFFMANN M, SZCESNY S. Innate mechanisms for Bifi dobacterium lactis to activate transient pro-inflammatory host responses in intestinal epithelial cells after the colonization of germfree rats[J]. Immunol, 2005, 115： 441-450.

[20] HALLER D, BODE C, HAMMES W P. Non-pathogenic bacteria elicit a differential cytokine response by intestinal epithelial cell/leucocyte co-cultures[J]. Gut, 2000, 47： 79-87.

[21] 呂學娜, 滿朝新, 韓琳琳, 等. 嗜酸乳桿菌NCFM對Caco-2細胞中PTX3基因表達的影響[J]. 微生物學報, 2011, 51(4)： 554-560.

[22] 張明生, 周云峰, 謝叢華, 等. 阻斷細胞信號傳導子和轉(zhuǎn)錄激活子6基因表達對人結(jié)腸癌細胞凋亡的影響[J]. 中華醫(yī)學雜志, 2006, 86(2)： 76-81.