黃 茜，杜昭平，馬成杰，潘能慶，劉 蕾，馬愛民,*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.乳業(yè)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，光明乳業(yè)股份有限公司技術(shù)中心，上海 200436)

乳酸菌作為基因工程菌表達(dá)外源蛋白時(shí)不會(huì)產(chǎn)生內(nèi)毒素[1]，而且經(jīng)改造后去除質(zhì)粒的乳酸菌菌株基本不表達(dá)本源蛋白[2]，這些優(yōu)點(diǎn)使其非常適合作為外源基因表達(dá)的宿主菌，所以乳酸菌食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建和應(yīng)用受到了研究者的重視。隨著研究的深入，糖誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)、pH值誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)、溫度敏感表達(dá)系統(tǒng)、乳鏈球菌素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)、噬菌體φ3l爆發(fā)式誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)等乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)被逐步建立[3-6]，并成功表達(dá)了人干擾素β、HPV-16 E7蛋白以及白細(xì)胞介素等多種外源物質(zhì)[7-9]。

乳酸菌屬于革蘭氏陽性菌，具有厚且致密的細(xì)胞壁，載體DNA轉(zhuǎn)化并進(jìn)入受體細(xì)胞難度較大。相對(duì)于常規(guī)化學(xué)方法和電轉(zhuǎn)化法，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法設(shè)備條件要求較低、方法簡(jiǎn)單、結(jié)果可靠，具有明顯的技術(shù)優(yōu)勢(shì)。原生質(zhì)體的制備與再生是實(shí)現(xiàn)乳酸菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的技術(shù)關(guān)鍵[10]，近年來，已有關(guān)于保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌及瑞士乳桿菌等乳酸菌原生質(zhì)體制備、再生及融合方面的研究報(bào)道[11-14]。

作為一種被公認(rèn)為安全的(generally regarded as safe，GRAS)食品級(jí)微生物，干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)及其微生態(tài)制品日益受到國內(nèi)外的重視，不但應(yīng)用于益生菌發(fā)酵乳制品的生產(chǎn)，而且成為食品級(jí)基因克隆和高效外源表達(dá)系統(tǒng)研究與開發(fā)的熱點(diǎn)[15-17]。L. casei LC2W(CGMCC No.0828)在模擬人體消化環(huán)境中具有較強(qiáng)的耐受性和優(yōu)異的存活性能，降高血壓等益生功能明顯，具備較強(qiáng)的應(yīng)用開發(fā)潛力[18]。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)影響L. casei LC2W原生質(zhì)體制備的因素以及原生質(zhì)體再生的條件進(jìn)行研究，以期為L(zhǎng). casei LC2W食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建和菌種改良提供前期的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與培養(yǎng)基

L. casei LC2W(冷凍干燥菌粉) 光明乳業(yè)股份有限公司；MRS培養(yǎng)基 德國Merck公司。

原生質(zhì)體制備液：0.2mol/L pH6.0磷酸鹽緩沖液(PBS)，含0.8mol/L甘露醇[19]；原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基(不含吐溫-80)中添加以下物質(zhì)(g/L)：明膠25.0、蔗糖171.2、氯化鈣2.8、氯化鎂5.0、胎牛血清(BSA)5.0、瓊脂15.0～18.0[20]。

1.1.2 酶與試劑

溶菌酶(用PBS配制成所需的不同質(zhì)量濃度梯度的酶液，經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌，現(xiàn)配現(xiàn)用) 韓國Biosharp公司；其他化學(xué)試劑(分析純) 上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Centrifuge 5415R臺(tái)式離心機(jī) 德國Eppendorf公司；AL204電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；SA-300VF高壓蒸汽滅菌器 德國Sturdy Industrial公司；Specteumlab22可見分光光度計(jì) 上海棱光技術(shù)有限公司；Bactron-Ⅰ厭氧培養(yǎng)箱 美國Shellab公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

將適量L. casei LC2W冷凍干燥菌粉接種于MRS液體培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)接活化2～3次后于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 L. casei LC2W生長(zhǎng)曲線測(cè)定[10]

以1%的接種量向新鮮MRS液體培養(yǎng)基中接種L. casei LC2W活化菌液，于37℃靜置培養(yǎng)，每隔2h取樣一次，以未接種的MRS液體培養(yǎng)基為參比，測(cè)定樣品在600nm波長(zhǎng)處的光密度(OD)值。

1.3.3 L. casei LC2W原生質(zhì)體制備[20]

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液，用無菌生理鹽水梯度稀釋至合適稀釋度，取0.1mL涂布于MRS固體培養(yǎng)基上，37℃倒置厭氧培養(yǎng)(48±2)h，計(jì)菌落數(shù)(A)。

取同時(shí)期菌液1mL于無菌離心管中，4000r/min離心5min，用原生質(zhì)體制備液洗滌2次，收集菌體，加入1mL一定濃度的酶液，保溫一定時(shí)間，4000r/min離心5min，用PBS洗滌1次，然后再用1mL的滅菌的去離子水重懸菌體并靜置10min，得到原生質(zhì)體懸液。

取上述原生質(zhì)體懸液1mL，經(jīng)無菌PBS緩沖液梯度稀釋至合適梯度后，取0.1mL涂布于MRS固體培養(yǎng)基上，37℃倒置厭氧培養(yǎng)(48±2)h，計(jì)菌落數(shù)為未形成原生質(zhì)體菌落數(shù)(B)。

1.3.4 L. casei LC2W原生質(zhì)體再生[20]

取上述原生質(zhì)體懸液1mL，用無菌PBS緩沖液稀釋至合適稀釋度后，取0.1mL涂布于再生培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)(48±2)h，計(jì)菌落數(shù)為酶解后再生菌落數(shù)(C)。

1.3.5 單因素試驗(yàn)確定影響原生質(zhì)體形成率的因素

菌齡：分別取在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)6、8、10、12、14h的菌體，在溶菌酶質(zhì)量濃度10mg/mL、酶解溫度37℃、酶解時(shí)間30min的條件下制備原生質(zhì)體，計(jì)算原生質(zhì)體形成率。

溶菌酶質(zhì)量濃度：收集在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)8h的菌體，分別用1、5、10、15、20mg/mL的酶液，在酶解溫度37℃、酶解30min的條件下制備原生質(zhì)體，計(jì)算原生質(zhì)體形成率。

酶解時(shí)間：收集在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)8h的菌體，在溶菌酶質(zhì)量濃度10mg/mL、酶解溫度37℃的條件下制備原生質(zhì)體，分別在酶解15、30、45、60、75、90min時(shí)取樣，計(jì)算原生質(zhì)體形成率。

酶解溫度：收集在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)8h的菌體，在溶菌酶質(zhì)量濃度10mg/mL，分別在20、28、37、42、50℃的酶解溫度下，酶解30min，制備原生質(zhì)體，計(jì)算原生質(zhì)體形成率。

1.3.6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用不同菌齡、溶菌酶質(zhì)量濃度、酶解時(shí)間和酶解溫度設(shè)計(jì)四因素三水平正交試驗(yàn)，以此來優(yōu)化干酪乳桿菌原生質(zhì)體的制備條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 L. casei LC2W的生長(zhǎng)曲線

圖 1 L. casei LC2W在MRS液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of L. casei LC2W in MRS broth

由圖1可知，L. casei LC2W在MRS液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，5h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，OD600nm值上升較快；15h左右進(jìn)入穩(wěn)定期，OD600nm值達(dá)到最大并基本維持穩(wěn)定；20h后進(jìn)入衰亡期，菌液OD600nm值開始下降。

2.2 菌齡對(duì)原生質(zhì)體形成率的影響

制備原生質(zhì)體時(shí)，一般選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌體，這主要是由于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)菌代謝旺盛，細(xì)胞壁肽聚糖含量最低，細(xì)胞壁對(duì)酶的作用最敏感，但處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)早期的菌體細(xì)胞相對(duì)脆弱，受酶的過度作用會(huì)影響原生質(zhì)體的再生率[20]。因此，本實(shí)驗(yàn)選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期的菌體細(xì)胞進(jìn)行原生質(zhì)體制備與再生，各菌齡下的原生質(zhì)體形成率如圖2所示。當(dāng)菌齡低于10h時(shí)，原生質(zhì)體形成率隨菌齡增加而升高，菌齡為10h時(shí)原生質(zhì)體形成率最高，達(dá)到95.24%；隨著菌齡的增加，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期的細(xì)胞代謝水平與活力下降，對(duì)酶的敏感性逐漸降低，原生質(zhì)體形成率也就隨之下降。

圖 2 菌齡對(duì)L. casei LC2W原生質(zhì)體制備的影響Fig.2 Effect of cell age on protoplast preparation of L. casei LC2W

由于處于不同生長(zhǎng)時(shí)期的菌體生理狀態(tài)不同，因此各時(shí)期的細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)、菌體的代謝水平及菌體的活力也都不同。L. casei LC2W菌株對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期的菌體細(xì)胞對(duì)溶菌酶的敏感性最高，孫磊等[21]的研究結(jié)果表明，具有最高轉(zhuǎn)化效率的細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期，韓璞等[10]的結(jié)果也驗(yàn)證了此觀點(diǎn)，因此選取該時(shí)期菌齡(8～12h)的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。

2.3 溶菌酶質(zhì)量濃度對(duì)原生質(zhì)體形成率的影響

圖 3 不同溶菌酶質(zhì)量濃度對(duì)L. casei LC2W原生質(zhì)體制備的影響Fig.3 Effect of lysozyme concentration on protoplast preparation of L. casei LC2W

溶菌酶質(zhì)量濃度對(duì)L. casei LC2W菌體原生質(zhì)體形成率的影響見圖3，當(dāng)酶質(zhì)量濃度為1mg/mL時(shí)，原生質(zhì)體的形成率僅為5.21%；隨著酶質(zhì)量濃度的升高，L. casei LC2W原生質(zhì)體形成率也不斷增加，當(dāng)酶質(zhì)量濃度為15mg/mL時(shí)，形成率達(dá)到最大值85.08%；當(dāng)酶質(zhì)量濃度進(jìn)一步升高時(shí)，原生質(zhì)體形成率略有降低，該結(jié)果與韓璞等[10]對(duì)羅伊氏乳桿菌原生質(zhì)體及張莉滟等[11]對(duì)保加利亞乳桿菌原生質(zhì)體的制備和再生結(jié)果一致。

分析認(rèn)為，溶菌酶質(zhì)量濃度較低時(shí)，對(duì)L. casei LC2W菌體細(xì)胞壁作用不完全，原生質(zhì)體形成率不高；酶質(zhì)量濃度的升高增加了酶分子與細(xì)胞壁接觸的機(jī)會(huì)，使得細(xì)胞壁被水解的幾率增大；當(dāng)溶菌酶質(zhì)量濃度超過最佳處理質(zhì)量濃度時(shí)，酶已處理完全，不再形成原生質(zhì)體；而酶質(zhì)量濃度過高時(shí)，在細(xì)胞壁水解完全后，可能會(huì)進(jìn)一步水解細(xì)胞膜上的部分蛋白成分引起細(xì)胞失活，甚至破裂，從而導(dǎo)致原生質(zhì)體形成率降低[22-23]。因此，適宜的溶菌酶質(zhì)量濃度是影響原生質(zhì)體制備的重要因素之一，本研究采用10、15、20mg/mL溶菌酶質(zhì)量濃度進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.4 酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體形成率的影響

圖 4 不同酶解時(shí)間對(duì)L. casei LC2W原生質(zhì)體制備的影響Fig.4 Effect of enzymolysis time on protoplast preparation of L. casei LC2W

溶菌酶酶解時(shí)間對(duì)L. casei LC2W菌體原生質(zhì)體形成率的影響如圖4所示。隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，L. casei LC2W原生質(zhì)體形成率隨之升高；當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)到75min時(shí)，原生質(zhì)體形成率最高為62.47%；但當(dāng)酶解時(shí)間延長(zhǎng)至90min時(shí)，原生質(zhì)體形成率反而有所降低，僅為60.38%。

適宜的酶解時(shí)間是制備原生質(zhì)體的重要條件。不同的微生物的最適酶解時(shí)間差異很大，仲松等[24]制備干酪乳桿菌ZZ-L原生質(zhì)體的最佳酶解時(shí)間為110min，王玉華等[12]制備嗜酸乳桿菌的最佳酶解時(shí)間為90min。酶解時(shí)間過短，酶對(duì)細(xì)胞壁作用不徹底，原生質(zhì)體制備率不高；酶解時(shí)間過長(zhǎng)將導(dǎo)致原生質(zhì)體皺縮，容易造成原生質(zhì)體活性降低，甚至?xí)p害細(xì)胞質(zhì)膜導(dǎo)致再生率急劇下降[22]。本研究選取60、75、90min 3個(gè)酶解時(shí)間進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.5 酶解溫度對(duì)原生質(zhì)體形成率的影響

溶菌酶酶解溫度對(duì)L. casei LC2W菌體原生質(zhì)體形成率的影響如圖5所示。當(dāng)酶解溫度從20℃升至42℃時(shí)，L. casei LC2W原生質(zhì)體形成率逐漸增加；當(dāng)酶解溫度達(dá)到42℃時(shí)，原生質(zhì)體形成率最高達(dá)85.71%；而酶解溫度繼續(xù)升高時(shí)，原生質(zhì)體形成率反而迅速下降。

圖 5 不同酶解溫度對(duì)L. casei LC2W原生質(zhì)體制備的影響Fig.5 Effect of enzymolysis temperature on protoplast preparation of L. casei LC2W

研究表明[25]，最適酶解溫度都要略高于微生物的最適生長(zhǎng)溫度。在低于最適酶解溫度時(shí)，隨著溫度的升高，原生質(zhì)體制備率不斷提高；高于最適酶解溫度時(shí)，由于細(xì)胞活性和酶活性都會(huì)受到高溫的影響，原生質(zhì)體的制備率也必然會(huì)受到影響。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取37、42、50℃ 3個(gè)酶解溫度進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.6 正交試驗(yàn)優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)確定的菌齡、溶菌酶質(zhì)量濃度、酶解時(shí)間和酶解溫度梯度，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，結(jié)果如表1所示。

表 1 正交試驗(yàn)優(yōu)化原生質(zhì)體制備條件Table 1 Results of orthogonal tests for optimizing protoplast formation of L. casei

由表1可知，極差分析結(jié)果表明，影響L. casei LC2W原生質(zhì)體形成的4因素主次順序?yàn)椋篈＞D＞B＞C，即菌齡＞酶解溫度＞溶菌酶質(zhì)量濃度＞酶解時(shí)間。L. casei LC2W原生質(zhì)體制備最佳條件為A1B1C2D2，即菌齡8h、溶菌酶質(zhì)量濃度10mg/mL、酶解時(shí)間75min、酶解溫度42℃，按此優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3次，取平均值，得原生質(zhì)體形成率為97.15%。

2.7 L.casei LC2W原生質(zhì)體的再生

經(jīng)優(yōu)化條件制備的L.casei LC2W原生質(zhì)體在再生培養(yǎng)基中生長(zhǎng)狀態(tài)良好，菌落形態(tài)如圖6所示，呈圓形，表面濕潤(rùn)光滑，乳白色，不透明。在此優(yōu)化條件下，L.casei LC2W原生質(zhì)體再生率為31.25%。

圖 6 L. casei LC2W原生質(zhì)體在再生培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Fig.6 Colony morphology of L. casei LC2W protoplast in regeneration medium

3 結(jié) 論

作為我國衛(wèi)生部2010年公布的可用于食品的益生菌菌種之一，干酪乳桿菌的安全性優(yōu)勢(shì)越來越受到研究者的青睞，成為食品級(jí)外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)的研究熱點(diǎn)。干酪乳桿菌細(xì)胞壁中肽聚糖含量較高，不利于進(jìn)行各種分子生物學(xué)操作，而使用去除細(xì)胞壁的原生質(zhì)體作為實(shí)驗(yàn)材料，可以提高基因工程操作的工作效率[26]。L. casei LC2W具備良好的益生功能和開發(fā)潛力，開展L. casei LC2W的原生質(zhì)體制備與再生條件的研究可以為L(zhǎng). casei LC2W的食品級(jí)外源表達(dá)系統(tǒng)的研究提供相關(guān)基礎(chǔ)，具有一定的實(shí)際意義和基礎(chǔ)應(yīng)用價(jià)值。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)影響L. casei LC2W原生質(zhì)體制備的因素進(jìn)行了分析和優(yōu)化，并確定最佳制備條件為：菌齡8h、溶菌酶質(zhì)量濃度10mg/mL、酶解時(shí)間75min、酶解溫度42℃，在此條件下，原生質(zhì)體的形成率達(dá)到97.15%，再生率為31.25%。

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