張俊生，陳莉華*，朱士龍，吳孝濤，肖 斌

(吉首大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖南 吉首 416000)

節(jié)節(jié)草為木賊科多年生草本植物，在《中國藥典》2010版中學(xué)名為木賊[1]，含黃酮[2]、生物堿[3]、植物多糖及有機硅等活性成分。節(jié)節(jié)草藥用歷史悠久，已有報道證實其具有降血脂、保護血管內(nèi)皮細胞、降低炎性因子分泌等效應(yīng)[4-6]。天然多糖由于具有抗氧化、防衰老、抗腫瘤、降血糖等生物活性在食品和藥品開發(fā)與利用方面已引起廣泛關(guān)注。從常見的植物食品如黃瓜[7]、蘆筍[8]、 野艾蒿[9]提取純化多糖的研究不斷見諸報道。國內(nèi)外目前已報道了200 多種天然多糖[10]，其中95%以上為植物多糖，充分利用植物多糖的天然無毒性開發(fā)各種功能性食品和保健品滿足了人類對天然產(chǎn)品的渴望。

本實驗以節(jié)節(jié)草為原料，采用超聲波輔助提取多糖，探討節(jié)節(jié)草多糖粗品和多糖純品的體外抗氧化活性，并與VC進行對比，以期為節(jié)節(jié)草資源的合理利用及進一步開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

節(jié)節(jié)草采于吉首本地，經(jīng)吉首大學(xué)資環(huán)學(xué)院植物學(xué)教研室鑒定確認。動物油為市售新鮮豬板油熬制而成，金健牌茶籽油(植物油)購于吉首本地超市。

苯酚、沒食子酸、VC、鄰苯三酚、三羥甲基氨基甲烷、冰醋酸、淀粉、KI、H2SO4、CHCl3、I2等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ250-E型超聲波清洗器、SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵、K-201B-Ⅱ旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；GZX-9070MBE數(shù)顯鼓風干燥箱 上海基瑋試驗儀器設(shè)備有限公司；723可見分光光度計 上海荊和分析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 節(jié)節(jié)草多糖的提取純化及含量測定

稱取一定量節(jié)節(jié)草粉末，按料液比1：10(m/V)加入蒸餾水，在溫度60℃、功率250W條件下超聲波提取40min，提取3次后合并濾液，減壓濃縮，濃縮液加入3倍量95%乙醇，醇沉兩次，將沉淀離心，用乙醚除脂質(zhì)2次，Sevag法除蛋白質(zhì)3次，再次離心收集上清液，即得到節(jié)節(jié)草多糖粗品溶液，將多糖粗品溶液以液料比10：1(V(多糖粗品)：m(樹脂))過D-101樹脂柱，0.2mol/L的NaCl溶液進行洗脫，收集洗脫液，得到節(jié)節(jié)草多糖純品溶液。

采用苯酚-硫酸法測定多糖含量[7-9]。以葡萄糖為對照品，波長490nm處測得吸光度(A)與葡萄糖質(zhì)量濃度(ρ)之間的回歸方程為：A=0.0055ρ－0.0053(R2=0.9998)，線性范圍：10～100μg/mL。多糖粗品溶液多糖含量8.42%，多糖純品溶液多糖含量30.57%。

1.3.2 節(jié)節(jié)草多糖提取液清除·OH作用測定

建立Fenton反應(yīng)體系模型[7-9]。取2mmol/L FeSO4溶液3mL于比色管中，加入1mmol/L H2O2溶液3mL，再加入6mmol/L水楊酸溶液3mL，立即搖勻，37℃水浴下加熱15min后取出，然后加入1.0mL提取液，繼續(xù)水浴加熱15min，以空白液為參比在波長510nm處測其吸光度AX。取1.0mL蒸餾水代替提取液按照以上方法進行檢測，37℃水浴恒溫15min后測得其吸光度A0，重復(fù)3次。以相同質(zhì)量濃度VC溶液作對比，按式(1)計算樣品對·OH的清除率。

式中：A0為空白對照液吸光度；Ax為待測樣品液吸光度；Ax0為本底吸光度。

1.3.3 節(jié)節(jié)草多糖提取液清除O2－·作用測定

鄰苯三酚在堿性條件下自氧化產(chǎn)生穩(wěn)定的O2－·并生成有色中間產(chǎn)物，可通過比色法檢測[7-9]。取pH8.2的50mmol/L Tris-HCl緩沖溶液4.5mL和1.0mL樣品提取液，混勻，室溫條件下放置4min，325nm波長處測定樣品吸光度(Aj)。再取Tris-HCl緩沖溶液4.5mL和7mmol/L鄰苯三酚3.0mL，混勻，室溫條件下放置4min，325nm波長測其吸光度(A0)。依上法，取Tris-HCl緩沖溶液4.5mL和1.0mL樣品提取液，混勻后在室溫條件下放置4min，加入3.0mL鄰苯三酚，計時，5min后于波長325nm處測定體系的吸光度(A)。以相同質(zhì)量濃度VC溶液作對比，計算樣品對O2－·清除率。

式中：A為樣品加入緩沖溶液及鄰苯三酚后的吸光度；Aj為樣品加入緩沖溶液后的吸光度；A0為緩沖溶液加入鄰苯三酚后的吸光度。

1.3.4 節(jié)節(jié)草多糖提取液對NO2－清除作用的測定

NO2－在酸性條件下與對氨基苯磺酸發(fā)生反應(yīng)，再與鹽酸萘乙二胺偶合形成紫紅色絡(luò)合物，該絡(luò)合物在波長538nm處有最大吸收，因此，可用分光光度法間接測定NO2－的量。

標準曲線繪制：精密吸取10μg/mL亞硝酸鈉溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于50mL容量瓶中，分別加入4g/L的對氨基苯磺酸溶液2.0mL，混勻，靜置5min，再加入2g/L的鹽酸萘乙二胺溶液1mL，加水至刻度，混勻，靜置15min。在波長538nm處測定吸光度，得標準曲線：A=0.3969ρ+0.0403(R2=0.9969)，NO2－在0～0.2μg/mL之間有良好的線性關(guān)系。

吸取1mL樣品液，加入10μg/mL的亞硝酸鈉溶液1.0mL，以相同質(zhì)量濃度VC溶液作對比，按照標準曲線方法計算NO2－量及樣品對NO2－的清除率。

式中：ρ為未加多糖提取液前由標準曲線計算得到的NO2－的量/(μg/mL)；ρ0為加入多糖提取液后由標準曲線計算得到的NO2－的量/(μg/mL)。

1.3.5 節(jié)節(jié)草多糖提取液抗油脂氧化實驗

參照文獻[1 1]繪制標準曲線并求出碘量-吸光度之間的數(shù)學(xué)關(guān)系。碘量(M，μmol)與吸光度A在0 ～0.96 μmol 間有良好的線性關(guān)系，回歸方程為M=4.0153A+0.0039(R2=0.9986)。

多糖提取液對油脂的抗氧化性采用國際上通用的烘箱強化貯存法：稱取20g油脂，加入2mL提取物，攪拌均勻后，放入烘箱中強化保存，間隔1h交換在烘箱中的位置并取1mL待測樣品，參照標準曲線方法分別測定波長585nm處的吸光度。以同質(zhì)量濃度VC溶液作對比，比較其抗氧化能力。按式(4)計算油脂過氧化值(POV)及多糖對油脂的氧化抑制率(η)。

式中：M表示碘生成量/mmol；m表示油脂質(zhì)量/kg。

式中：POV初為未對油脂進行強化氧化時的過氧化值/(mmol/kg)；POV末1為添加多糖的油脂強化氧化后的過氧化值/(mmol/kg)；POV末2為未添加多糖的油脂強化氧化后的過氧化值/(mmol/kg)。

取相同質(zhì)量濃度的節(jié)節(jié)草多糖溶液加入到20g植物油和豬油中，充分攪拌后，分別置于40、50、60℃烘箱內(nèi)，間隔1h取樣檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 節(jié)節(jié)草多糖質(zhì)量濃度對清除·OH的影響

圖 1 多糖質(zhì)量濃度對·OH清除率的影響Fig.1 Concentration-dependent scavenging activity of crude and purifi ed polysaccharides from Equisetum ramosissimum Desf. against ·OH

由圖1可知，節(jié)節(jié)草多糖粗品、純化品清除·OH的作用均比較明顯；在質(zhì)量濃度0～0.9mg/mL范圍內(nèi)，隨著兩種多糖質(zhì)量濃度的增大，清除率逐漸升高，但均低于VC的清除率；此外，節(jié)節(jié)草粗多糖對·OH的清除率均較純化多糖高?？傮w而言，對·OH清除率的大小排序為：VC＞節(jié)節(jié)草多糖粗品＞節(jié)節(jié)草多糖純化品。

2.2 節(jié)節(jié)草多糖質(zhì)量濃度對清除O2－·的影響

圖 2 多糖質(zhì)量濃度對O－2·清除率的影響Fig.2 Concentration-dependent scavenging activity of crude and purif eid polysaccharides from Equisetum ramosissimum Desf. against O2－·

由圖2可知，在實驗所選取質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，兩種節(jié)節(jié)草多糖對O2－·的清除率具有相同趨勢，都是隨著多糖質(zhì)量濃度的增大而升高，節(jié)節(jié)草多糖粗品的清除率略好于多糖純化品，但明顯都較VC的清除率低。

2.3 節(jié)節(jié)草多糖質(zhì)量濃度對清除NO2－的影響

圖 3 多糖質(zhì)量濃度對NO2－清除率的影響Fig.3 Concentration-dependent scavenging activity of crude and purifi ed polysaccharides from Equisetum ramosissimum Desf. against NO2－

由圖3可知，隨著多糖質(zhì)量濃度的增大，3種溶液對NO2－的清除率均呈上升趨勢，且VC對NO2－的清除率最高。在質(zhì)量濃度為0.23mg/mL時，VC對NO2－的清除率已大于97.5%，質(zhì)量濃度大于0.3mg/mL后，清除率上升不明顯，基本穩(wěn)定在98%左右。多糖粗品、多糖純化品對NO2－的清除率也隨質(zhì)量濃度的升高而增大，但在實驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，多糖粗品清除率均好于多糖純化品。

2.4 節(jié)節(jié)草多糖對·OH、O－2·及NO2－清除能力比較

由表1、2可知，節(jié)節(jié)草多糖粗品、多糖純化品均對·OH、O2－·及NO2－有很好的清除作用，相同質(zhì)量濃度下，兩種多糖的清除能力為：NO2－＞O2－·＞·OH，但多糖粗品清除率均高于多糖純化品。

表 1 不同質(zhì)量濃度的多糖粗品對·OH、O－2·及NO2－的清除率Table 1 Scavenging activity of crude polysaccharides from Equisetum ramosissimum Desf. at different concentrations against ·OH, O2－· and NO2－%

表 2 不同質(zhì)量濃度的多糖純化品對OH、O2- 及NO2- 的清除率Table 2 Scavenging activity of purififi ed polysaccharides from Equisetum ramosissimum Desf. at different concentrations against OH, O2-and NO2- %

一般來說，植物多糖的活性與其分子質(zhì)量、溶解度、黏度和化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)[12]。富硒花生中的粗多糖相對于純化多糖，具有更長的誘導(dǎo)時間、更高的DPPH自由基清除能力和更高的還原力[13]，對蟲草與富硒蟲草多糖的體外抗氧化活性研究表明，蟲草多糖對O2－·和H2O2的清除能力依次為富硒蟲草胞外多糖＞富硒蟲草胞內(nèi)多糖＞蟲草胞外多糖＞蟲草胞內(nèi)多糖，而對·OH的清除能力依次為：富硒蟲草胞外多糖＞蟲草胞外多糖＞富硒蟲草胞內(nèi)多糖＞蟲草胞內(nèi)多糖[14]。多糖的活性還與共存的植物蛋白有關(guān)，對娑羅子多糖的生物活性研究表明，對·OH、H2O2和DPPH自由基的清除作用，粗多糖的活性強于去蛋白多糖[15]。本研究結(jié)果也表明，節(jié)節(jié)草中的多糖粗品比去蛋白后的多糖純化品具有更好的清除·OH、O2－·、NO2－的能力。

2.5 多糖對油脂的抗氧化活性

2.5.1 溫度對多糖抗油脂氧化效果的影響

由圖4可知，在測定節(jié)節(jié)草多糖粗品對植物油氧化抑制率的過程中，溫度對測定結(jié)果的影響很大。3種溫度條件下，多糖對植物油氧化抑制率均隨時間的延長先增大后又降低。此外，40～50℃時，隨著溫度的升高，多糖的氧化抑制率也不斷升高，但溫度升高至60℃時，多糖對油樣的氧化抑制率反而下降。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是在加熱條件下，引發(fā)了植物油發(fā)生了自氧化反應(yīng)，同時溫度較高使多糖的熱穩(wěn)定性降低，造成抗氧化劑對植物油的氧化抑制率降低。

同樣，節(jié)節(jié)草多糖粗品對動物油氧化抑制與對植物油的抑制效果相似，均是隨著溫度的升高，抑制率先上升后下降，比較圖4a和圖4b可以明顯看出：節(jié)節(jié)草多糖粗品對植物油的氧化抑制率隨溫度的變化更為明顯，在相同條件下，節(jié)節(jié)草多糖粗品對植物油氧化抑制效果大于對動物油的氧化抑制效果。

圖 4 溫度對多糖抑制油脂氧化的影響Fig.4 Infl uence of temperature on anti-lipid oxidation activity of crude polysaccharides from Equisetum ramosissimum Desf.

2.5.2 多糖純化前后對油脂的抗氧化性比較

分別比較了VC、節(jié)節(jié)草多糖粗品、純化品對植物油和動物油的抗氧化效果。分別在20g植物油和豬油中加入質(zhì)量濃度均為0.5mg/mL的節(jié)節(jié)草多糖粗品溶液、多糖純品溶液及VC溶液2mL，混合均勻后，分別置于40℃烘箱內(nèi)，每隔1h取樣檢測，結(jié)果見表3、4。

表 3 多糖純化前后對植物油氧化抑制率比較Table 3 Antioxygen on antioxidation activity of polysaccharide to vegetable oil %

表 4 多糖純化前后對動物油氧化抑制率比較Table 4 Antioxygen on antioxidation activity of polysaccharide to fat%

由表3、4可知，相同質(zhì)量濃度條件下，節(jié)節(jié)草多糖粗品、多糖純化品對植物油和豬油均有較好的抗氧化效果，對動物油來說，節(jié)節(jié)草多糖粗品抗氧化效果明顯弱于多糖純化品，而對植物油來說，卻無顯著差別，但兩者均不及VC的抗氧化作用，在烘箱放置時間變化很大時，多糖粗品對油樣的抑制率變化并不大，而多糖純化品對油樣的抑制率變化比較大。

3 結(jié) 論

節(jié)節(jié)草多糖粗品及純化品的體外抗氧化結(jié)果表明，二者在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對·OH、O2－·及NO2－均有一定的清除作用，且清除效果與多糖質(zhì)量濃度有劑量效應(yīng)關(guān)系。

在清除·OH、O2－·及NO2－時，相同質(zhì)量濃度條件下節(jié)節(jié)草多糖純化品的清除效果均弱于同質(zhì)量濃度的多糖粗品，這是因為植物多糖的活性與其不僅與其分子質(zhì)量、溶解度、黏度和化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)，而且與共存的植物蛋白也有關(guān)系，在清除自由基方面，含植物蛋白的粗多糖往往比純化多糖效果更好。

節(jié)節(jié)草多糖粗品及純化品對植物油及動物油均有一定的抗氧化效果，總體而言，多糖粗品對植物油氧化抑制率大于對動物油氧化抑制率，但受溫度、時間的影響變化較大。

節(jié)節(jié)草多糖具有良好的抗氧化能力，原料來源廣，提取工藝簡單，作為一種新的天然、保健的綠色食品抗氧化劑應(yīng)有良好的開發(fā)前景。

[1] 中國藥典委員會. 中國藥典 2010年版一部[M]. 北京： 中國醫(yī)藥科技出版社, 2010： 42-43.

[2] 張俊生, 陳莉華, 張文龍. 湘西節(jié)節(jié)草總黃酮的超聲波提取及抗氧化研究[J]. 食品科學(xué), 2011, 32(16)： 71-75.

[3] 陳莉華, 張俊生, 張麗, 等. 湘西節(jié)節(jié)草總生物堿的提取及抑菌性研究[J]. 湖南農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011(9)： 101-104.

[4] 李志永, 李國拉, 王輝, 等. 木賊有效部位提取物對氧化低密度脂蛋白致內(nèi)皮細胞凋亡的干預(yù)[J]. 中國老年學(xué)雜志, 2010, 30 (15)： 2160-2162.

[5] 甄艷軍, 劉志敏, 姜秀娟, 等. 兩種木賊提取物對高血脂大鼠內(nèi)皮凋亡及p53、caspase-3表達干預(yù)[J]. 中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志, 2008, 14 (2)： 154-155.

[6] 丁曉猛, 姜秀娟, 王旭輝, 等. 木賊水煎劑對大鼠食餌性脂肪肝的干預(yù)作用[J]. 中國老年學(xué)雜志, 2010, 30(21)： 3136-3138.

[7] 何念武, 楊興斌, 田靈敏, 等. 黃瓜多糖的體外抗氧化活性[J]. 食品科學(xué), 2011, 32(19)： 70-74.

[8] 李姣, 王珂, 王瑞坡, 等. 蘆筍多糖提取純化工藝及其體外抗氧化研究[J]. 食品科學(xué), 2011, 32(8)： 65-69.

[9] 戴喜末, 熊子文, 羅麗萍. 響應(yīng)面法優(yōu)化野艾蒿多糖的超聲波提取及其抗氧化性研究[J]. 食品科學(xué), 2011, 32(8)： 93-97.

[10] 倪福太, 莊妍. 植物多糖的研究進展(綜述)[J]. 牡丹江師范學(xué)院學(xué)報, 2010(4)： 34-36.

[11] 孫德明. 碘量比色法在食品油脂測定中的應(yīng)用[J]. 黑龍江科技信息, 2009(4)： 47.

[12] 鄭建仙. 功能性食品學(xué)[M]. 2版. 北京： 中國輕工業(yè)出版社, 2011： 27.

[13] 張卓, 趙萍, 王雅, 等. 富硒花生中硒的主要賦存形態(tài)及其抗氧化性[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2011, 37(4)： 87-91.

[14] 武忠偉, 許桂芳, 曹蓬勃, 等. 蟲草與富硒蟲草多糖的體外抗氧化活性[J]. 食品科學(xué), 2011, 32(9)： 76-78.

[15] 邊靜靜, 付娟, 趙樺. 婆羅子多糖的提取、含量測定及生物學(xué)活性研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2010(10)： 72-75; 77.