陳 梅，呂春華，朱曉雨，陳笑梅,*，莫衛(wèi)民

(1.浙江工業(yè)大學(xué)化學(xué)工程與材料學(xué)院，浙江 杭州 310014；2.浙江出入境檢驗(yàn)檢疫局，浙江 杭州 310016)

甲醛具有較高的毒性，已被世界衛(wèi)生組織(WHO)確定為致癌和致畸的物質(zhì)。近年來，“大白兔奶糖含甲醛”、食品中違禁使用吊白塊和水發(fā)產(chǎn)品用甲醛浸泡等事件頻繁發(fā)生，已成為全球關(guān)注的焦點(diǎn)。大量研究[1]表明甲醛可在動(dòng)植物體內(nèi)自然產(chǎn)生，是一種自身的代謝產(chǎn)物，是某些氨基酸生物合成所必需的前提物質(zhì)。Yamagata等[2]發(fā)現(xiàn)甲醛可在一些蔬菜、水果、發(fā)酵制品中自然產(chǎn)生，Bianchi等[3]在水產(chǎn)中檢測到有較高本底含量的內(nèi)源性甲醛。張文德[4]發(fā)現(xiàn)食用菌類、水產(chǎn)品、果蔬類、糧食類、乳制品等食品中均含有天然甲醛。馬永均等[5]調(diào)查表明，在66個(gè)水果樣品中，甲醛含量超過1.0mg/kg的有11個(gè)，1.0～0.5mg/kg的有22個(gè)，小于0.5mg/kg的有33個(gè)。水果(植物)呼吸作用使復(fù)雜的有機(jī)物質(zhì)在酶的作用下緩慢分解為簡單有機(jī)物——醇類、酮類、醛類以及CO2和水等，在細(xì)胞代謝的生化過程中會產(chǎn)生微量的甲醛。乳品中的甲醛來源于乳脂肪的酶類反應(yīng)和氨基化合物等物質(zhì)的美拉德反應(yīng)，是復(fù)雜反應(yīng)過程中代謝或產(chǎn)生的中間產(chǎn)物[4]。各種乳制品中能測出包括甲醛在內(nèi)的多種羰基化合物，鮮牛乳中曾分離出甲醛、乙醛、丙醛、己醛、苯甲醛等物質(zhì)[4]，乳酸菌都有生產(chǎn)甲醛及乙醛的能力，例如，在蛋白質(zhì)分解酶的作用下，乳蛋白生成肽、氨基酸類化合物在微生物的作用下脫去氨基后，可以轉(zhuǎn)變?yōu)槿?、酮、醇類，產(chǎn)生奶酪特有的風(fēng)味[6]。文獻(xiàn)[7-9]報(bào)道，食品中內(nèi)源性甲醛的生成也可能和其加工的工藝有關(guān)。

乳制品含有豐富的蛋白質(zhì)和還原糖，其主要蛋白——酪蛋白和乳清蛋白的賴氨酸殘基活性較強(qiáng)，易與乳糖發(fā)生美拉德反應(yīng)[10]。文獻(xiàn)[11]報(bào)道美拉德反應(yīng)原理為Amadori產(chǎn)物裂解產(chǎn)生羰基和α-二羰基化合物會繼續(xù)與氨基化合物反應(yīng)，使氨基化合物失去1分子CO2生成少1個(gè)碳原子的醛類。馮大炎等[12]認(rèn)為面包烘烤時(shí)美拉德反應(yīng)和Strecker降解反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行產(chǎn)生了一些醛酮類物質(zhì)，如甲醛、丙醛、異戊醛等。陳華[13]認(rèn)為相等量的甘氨酸和葡萄糖混合加熱100～150℃時(shí)產(chǎn)生的Strecker醛類為甲醛。

本實(shí)驗(yàn)針對奶糖中的甲醛問題，調(diào)查奶糖原料乳粉和糖類中甲醛的本底含量及其高溫處理后甲醛含量的變化；找出乳粉是奶糖內(nèi)源性甲醛形成的關(guān)鍵物質(zhì)，進(jìn)一步分析乳粉高溫體系甲醛生成的特性；模擬奶糖熬糖工藝，考察不同糖類的添加對乳粉高溫處理甲醛生成的影響；通過對乳粉主要成分分析進(jìn)一步找出乳粉中甲醛形成的關(guān)鍵物質(zhì)并驗(yàn)證其高溫反應(yīng)特性，以期闡明奶糖中內(nèi)源性甲醛生成的機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大白兔牌奶糖為市售；伊利、光明、雅士利等品牌乳粉(蛋白質(zhì)含量18.5%～40.0%、乳糖含量31.5%～54.8%)為市售。

甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液(100μg/mL) 環(huán)境保護(hù)部標(biāo)準(zhǔn)樣品研究所；2,4-二硝基苯肼(DNPH，優(yōu)級純) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；酪蛋白、乳清蛋白 上海源聚生物科技有限公司；乳糖 上海伯奧生物科技有限公司；葡萄糖、蔗糖、果糖 美國Acros Organics公司；甘油 江蘇強(qiáng)盛化工有限公司；乙腈、甲醇(色譜純) 美國Tedia公司；所有試劑均為分析純，所用水為去離子水。

配制的DNPH溶液：稱取DNPH 0.50g，用乙腈溶解并定容至250mL，質(zhì)量濃度為2g/L。pH5磷酸鹽緩沖液：稱取13.6g KH2PO4，加入500mL水中，混勻后用NaOH溶液調(diào)至pH5.0。配制的衍生液：將DNPH溶液與pH5.0磷酸鹽緩沖液，按體積比1：1混合。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1200高效液相色譜儀(配G1315B二極管陣列檢測器) 美國Agilent公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；恒溫振蕩器 太倉市科教器材廠；高速離心機(jī) 美國Thermo公司；電子天平(感量0.0001g) 瑞士Mettler Toledo公司；旋渦混合器 太倉華利達(dá)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備公司。

1.3 方法

1.3.1 甲醛生成模擬與定量

稱取2.25g甘油于8mL螺紋口樣品瓶中，加入0.25g樣品(乳粉、酪蛋白、乳清蛋白)，再按一定比例加入一定量的糖(糖添加實(shí)驗(yàn)、乳粉內(nèi)源性甲醛生成因子探究實(shí)驗(yàn))，旋緊螺帽。于80℃水浴中靜置10min，渦旋混勻。置于烘箱中120℃加熱60min。

1.3.2 甲醛生成特性

參考1.3.1節(jié)準(zhǔn)備樣品。在相同加熱時(shí)間條件下，將完全混勻的樣品分別置于60、80、100、120℃加熱60min；相同加熱溫度條件下，將全混勻的樣品置于120℃烘箱中分別加熱20、40、60、80、100min。

1.3.3 甲醛的測定

1.3.3.1 甲醛的衍生反應(yīng)

常溫條件下，稱取2.00g樣品于50mL塑料離心管中，加入20mL衍生液。高溫處理后的樣品，用20mL衍生液將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至50mL塑料離心管中。旋緊管塞，渦旋混勻。置于60℃恒溫振蕩器中，150r/min振搖提取60min，取出冷卻至室溫。

1.3.3.2 凈化

將1.3.3.1節(jié)的提取液，以不低于4000r/min離心5min。若離心后溶液澄清，過0.45μm微孔濾膜，濾液供HPLC法測定。若離心后溶液渾濁或分層，在提取液中加入8g硫酸銨，混勻，以不低于4000r/min離心5min。移取上清液于20mL刻度試管中，下層溶液用10mL乙腈重復(fù)萃取1次，合并上清液，用乙腈定容至20.0mL，混勻后過0.45μm微孔濾膜，濾液供HPLC法測定。

1.3.4 甲醛衍生物標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

[14]，分別移取適量的甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液，于10mL具塞刻度試管中，用衍生液定容至10mL。蓋上塞后混勻，于60℃水浴中加熱60min，取出冷卻至室溫。溶液過0.45μm微孔濾膜，濾液供HPLC法測定。高溫體系甲醛的測定實(shí)驗(yàn)，甲醛標(biāo)準(zhǔn)的衍生體系中需分別加甘油0.90g，參見上述操作制備。

1.3.5 色譜條件

色譜柱：Agilent色譜柱C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相：乙腈-水(60：40，V/V)；流速：1.0mL/min；柱溫30℃； 檢測波長：350nm；進(jìn)樣量：10μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫處理中甲醛的收集及檢測方法的研究

2.1.1 高溫處理中甲醛收集方法的研究

奶糖熬糖工藝在120℃，為研究在此溫度條件下奶糖及其各成分甲醛的含量變化，首先需研究這些物質(zhì)在高溫處理時(shí)甲醛的收集方法。因甲醛是揮發(fā)性物質(zhì)，奶糖及其各成分經(jīng)高溫處理產(chǎn)生的甲醛，若沒有收集直接冷卻測定，甲醛將部分揮發(fā)。本實(shí)驗(yàn)比較了甘油體系和水體系對奶糖經(jīng)高溫處理產(chǎn)生的甲醛的收集效果，結(jié)果表明，甘油體系的實(shí)驗(yàn)結(jié)果重現(xiàn)性較好。甘油沸點(diǎn)較高，120℃時(shí)仍為液態(tài)，反應(yīng)體系的均勻性和熱傳導(dǎo)性較好；水沸點(diǎn)為100℃，120℃時(shí)轉(zhuǎn)化為氣態(tài)，揮發(fā)帶走部分甲醛，反應(yīng)體系均勻性不佳，對實(shí)驗(yàn)裝置的密封性要求高，而且存在因壓力過大爆炸的風(fēng)險(xiǎn)。

2.1.2 甘油體系中甲醛檢測方法的研究

參考文獻(xiàn)[15]，衍生液提取法能夠有效提取樣品中游離態(tài)和可逆結(jié)合態(tài)的甲醛，同時(shí)避免樣品中內(nèi)源性甲醛的形成，是一種較合理的前處理方法。文獻(xiàn)中甲醛的衍生反應(yīng)在水-乙腈(1：1，V/V)的體系中進(jìn)行，本實(shí)驗(yàn)甲醛的衍生體系中含有甘油，需考察甘油對衍生反應(yīng)的影響。在甲醛衍生物標(biāo)準(zhǔn)溶液中加入一定量的甘油，通過比較衍生產(chǎn)物的峰面積考察甘油對甲醛衍生反應(yīng)的影響，結(jié)果表明：甘油含量≤2mL時(shí)，甲醛衍生物的峰面積與不加甘油時(shí)相比，誤差在5%以內(nèi)。此時(shí)，甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.2～10.0m/kg的線性方程為y=345.8x+20.33，相關(guān)系數(shù)R2≥0.99990。甘油含量＞2mL，試劑空白偏高，線性關(guān)系不佳。

2.2 高溫處理對奶糖主要成分糖類甲醛生成的影響

圖 1 奶糖經(jīng)高溫處理后甲醛含量的變化Fig.1 Change of formaldehyde content in different carbohydrates treated at 120 ℃ for 60 min

考察奶糖的主要原料糖類經(jīng)高溫處理后甲醛含量的變化，以探究奶糖中內(nèi)源性甲醛生成的主要原因。見圖1。糖類的甲醛本底值均較低，高溫處理后4種糖的甲醛含量略有增加，其中葡萄糖中的甲醛含量變化最大，由0.46mg/kg增加到5.65mg/kg。糖類中甲醛略有增加，可能是因?yàn)樘穷愇镔|(zhì)高溫時(shí)分解產(chǎn)生小分子質(zhì)量代謝產(chǎn)物甲醛[16]。

2.3 高溫處理對奶糖原料乳粉甲醛生成的影響

如圖2所示，6種乳粉的甲醛本底值為0.58～2.97mg/kg，高溫處理后甲醛含量增加至12.6～23.7mg/kg。6種乳粉中A、B、C、D、E為成人乳粉，F(xiàn)為嬰兒乳粉，表明乳粉高溫處理后甲醛含量顯著增加具有普遍性。A、B為同一品牌的脫脂乳粉和全脂乳粉，高溫處理后甲醛含量分別為15.9、12.6mg/kg，無顯著性差異(P＞0.05)，表明乳粉中脂肪不是影響高溫甲醛生成的主要因素。

圖 2 乳粉經(jīng)高溫處理后甲醛含量的變化Fig.2 Change of formaldehyde content in different milk powder treated at 120 ℃ for 60 min

2.4 乳粉高溫體系甲醛生成的影響因素

2.4.1 加熱溫度和時(shí)間對乳粉甲醛生成的影響

圖 3 乳粉-甘油體系甲醛生成的溫度曲線(a)和時(shí)間曲線(b)Fig.3 Temperature curve (a) and time curve (b) for the generation of formaldehyde in milk powder-glycerin system

由圖3a可知，隨著加熱溫度升高甲醛含量增加。溫度高于80℃時(shí)，甲醛生成顯著(P＜0.05)；加熱溫度為100℃和120℃時(shí)，甲醛含量分別是本底值的16.9倍和34.6倍。由圖3b可知，加熱時(shí)間為20～60min時(shí)，甲醛生成量隨加熱時(shí)間延長而顯著增加(P＜0.05)，至60min時(shí)，甲醛的生成量達(dá)到最大；在60～100min之間甲醛生成速率變緩。馬志玲等[10]研究表明熱處理的強(qiáng)度越大，乳糖與賴氨酸殘基的結(jié)合越強(qiáng)烈，美拉德反應(yīng)越容易進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，溫度大于80℃，加熱時(shí)間越長，產(chǎn)生的甲醛含量越多，超過60min后，甲醛含量基本不變。因此選擇乳粉-甘油體系120℃高溫處理60min作為乳粉高溫體系處理?xiàng)l件。

2.4.2 糖類添加對乳粉高溫處理甲醛生成的影響

由圖4可知，隨著乳糖、葡萄糖、果糖量增加，甲醛生成量隨之增大；其中葡萄糖的添加影響最顯著(P＜0.05)，甲醛的最高生成量為182.5mg/kg，果糖和乳糖次之，甲醛的最高生成量分別為45.9、31.9mg/kg，蔗糖添加對甲醛生成影響不明顯。4種糖添加對乳粉高溫處理甲醛生成影響的順序?yàn)槠咸烟牵竟牵救樘牵菊崽牵@與Mauron[17]的研究結(jié)果一致，即美拉德反應(yīng)的難易順序?yàn)槲逄既┨牵炯喝┨牵炯和牵倦p糖。蔗糖、乳糖為雙糖，還原性較弱，反應(yīng)活性小于單糖。吳惠玲等[18]的研究表明，蔗糖是非還原糖，不含游離的羰基，沒有顯示出與氨基酸的反應(yīng)活性。因此添加蔗糖不會導(dǎo)致乳粉熱處理甲醛含量的升高。葡萄糖為醛糖，果糖為酮糖，醛糖的末端基團(tuán)位阻效應(yīng)小，更易于氨基化合物反應(yīng)，因此葡萄糖的反應(yīng)活性大于果糖的反應(yīng)活性[16]。

2.5 乳粉內(nèi)源性甲醛生成主要因子的探究

圖 5 酪蛋白(乳清蛋白)-乳糖-甘油體系高溫甲醛的生成Fig.5 The generation of formaldehyde in casein (whey protein)-lactoseglycerin system treated at 120 ℃ for 60 min

美拉德反應(yīng)主要是羰基化合物和氨基化合物間的反應(yīng)。牛乳中90%以上的蛋白質(zhì)為酪蛋白和乳清蛋白，且這兩種蛋白的賴氨酸殘基都有很高的反應(yīng)活性，較易與還原糖乳糖反應(yīng)[10,19]。如圖5所示，酪蛋白高溫甲醛的生成量隨著乳糖的添加增加較明顯，至質(zhì)量比為1：5時(shí)甲醛的生成量最大。乳清蛋白高溫甲醛的生成不明顯。這是因?yàn)槔业鞍讓岵幻舾?，而乳清蛋白熱處理時(shí)容易變性[20]。因此，乳清蛋白熱處理時(shí)賴氨酸殘基失活，影響美拉德反應(yīng)導(dǎo)致甲醛生成不明顯。

酪蛋白-乳糖-甘油體系在高溫條件下甲醛生成量的變化趨勢與乳粉-乳糖-甘油體系的趨勢一致，而且生成的甲醛量也相近，見圖4a，當(dāng)乳粉與乳糖1：1混合時(shí)，乳粉生成的甲醛量最高。因?qū)嶒?yàn)所用乳粉中酪蛋白含量為26.4%，乳糖含量為47.3%，乳粉與乳糖含量為1：1相當(dāng)于酪蛋白與乳糖的質(zhì)量比為1：5.6。這與圖5中酪蛋白與乳糖比為1：5時(shí)，生成的甲醛量最多相吻合。當(dāng)乳粉與乳糖質(zhì)量比為1：1混合時(shí)，乳粉甲醛的生成量為31.9mg/kg，酪蛋白在乳粉中的含量為26.4%，相當(dāng)于每千克酪蛋白產(chǎn)生的甲醛量為120.8mg。這與圖5中酪蛋白與乳糖質(zhì)量比為1：5時(shí)，酪蛋白產(chǎn)生甲醛的生成量為130.4mg/kg相近。因此，乳粉內(nèi)源性甲醛的生成主要是由酪蛋白和乳糖發(fā)生美拉德反應(yīng)產(chǎn)生的。

2.6 酪蛋白-乳糖-甘油模擬體系高溫甲醛生成的特點(diǎn)

考察加熱溫度和時(shí)間對酪蛋白-乳糖-甘油體系(酪蛋白、乳糖添加質(zhì)量比為1：3)甲醛生成的影響，見圖6。該體系低于80℃處理時(shí)甲醛的生成不明顯，高于80℃處理時(shí)甲醛的生成開始顯著增加，120℃時(shí)甲醛含量最高。這與圖3a乳粉-甘油體系高溫甲醛生成的趨勢相似。體系在加熱20～60min時(shí)，甲醛的生成隨著加熱時(shí)間的延長逐漸增加，到60min時(shí)甲醛的生成最明顯，60min后甲醛的生成量基本不變。與圖3b乳粉-甘油體系高溫甲醛生成的趨勢相似。因此，酪蛋白-乳糖-甘油體系高溫甲醛的消長趨勢與乳粉-甘油體系高溫甲醛的消長趨勢相似。

圖 6 酪蛋白-乳糖-甘油體系甲醛生成的溫度曲線(a)和時(shí)間曲線(b)Fig.6 Temperature curve (a) and time curve (b) of the generation of formaldehyde in casein-lactose-glycerin system

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)研究了甘油體系收集樣品經(jīng)高溫處理生成甲醛的方法及收集后甲醛的檢測方法。通過對奶糖主要成分乳粉和糖類進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)乳粉是奶糖中甲醛生成的主要物質(zhì)，在分析乳粉主要成分蛋白和糖類時(shí)發(fā)現(xiàn)酪蛋白和乳糖的美拉德反應(yīng)是奶糖甲醛生成的根本原因。乳清蛋白對甲醛的生成基本無影響，不同糖類的影響也不同，依次為葡萄糖＞果糖＞乳糖＞蔗糖。

參考文獻(xiàn)：

[1] OWEN B A, DUDNEY C S, TAN E L, et al. Formaldehyde in drinking water： comparative hazard evaluation and an approach to regulation[J]. Regulation Toxicology and Pharmacology, 1990, 11(3)： 220-236.

[2] YAMAGATA M, LOW L K. Rapid determination of formaldehyde in banana shrimp penaeus[J]. Journal of Food Science, 1995, 60(4)： 718-720.

[3] BIANCHI F, CARERI M, MUSCI M, et al. Fish and food safety： determination of formaldehyde in 12 fish species by SPME extraction and GC-MS analysis[J]. Food Chemistry, 2007, 100： 1049-1053.

[4] 張文德. 食品中甲醛的來源及檢測意義[J]. 中國食品衛(wèi)生雜志, 2006, 18(5)： 455-459.

[5] 馬永均, 安利華, 鄭萬源, 等. 中國常見水果甲醛本底值調(diào)查及含量分析[J]. 食品科技, 2003(3)： 221-224.

[6] PARKIN K L, HULTIN H O. A membrane fraction from red hake muscle catalyzing the conversion of TMAO to dimethylamine and formaldehyde[C]. International Institute of Refrigeration Joint Meeting of Commission C-2, D1-D2, D3, Boston, USA, 1981： 568-597.

[7] 丁曉雯, 刁恩杰. 半胱氨酸對香菇甲醛含量控制及控制機(jī)理[J]. 食品科學(xué), 2006, 27(8)： 133-135.

[8] 刁恩杰, 丁曉雯, 章道明. 干燥方式對香菇中甲醛含量的影響[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(2)： 70-73.

[9] 朱軍莉, 勵(lì)建榮. 魷魚及其制品加工貯存過程中甲醛的消長規(guī)律研究[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(5)： 14-17.

[10] 馬志玲, 王延平, 吳京洪, 等. 乳及乳制品中加工中的美拉德反應(yīng)[J]. 中國乳品工業(yè), 2002, 30(3)： 8-10.

[11] 張永忠, 趙新淮, 李鐵晶, 等. 乳品化學(xué)[M]. 北京： 科學(xué)出版社, 2007： 277-278.

[12] 馮大炎, 周運(yùn)友. Maillard反應(yīng)與Strecker降解及其對食品風(fēng)味與食品營養(yǎng)的影響[J]. 安徽師范大學(xué)學(xué)報(bào)： 自然科學(xué)版, 1993, 16(2)： 79-84.

[13] 陳華. 影響食品中美拉德反應(yīng)的因素[J]. 四川食品與發(fā)酵, 1998(3)： 21-23.

[14] 陳笑梅, 施旭霞, 朱衛(wèi)建, 等. 高效液相色譜直接測定甲醛衍生物反應(yīng)條件的研究[J]. 分析化學(xué), 2004, 32(11)： 1421-1425.

[15] 呂春華, 陳梅, 陳笑梅, 等. 衍生液提取-高效液相色譜法測定食品中甲醛[J]. 理化檢驗(yàn)： 化學(xué)分冊, 2011, 47(9)： 1005-1008.

[16] BAKER P R. The generation of formaldehyde in cigarettes-overview and recent experiments[J]. Food and Chemical Toxicology, 2006, 44(11)： 1799-1822.

[17] MAURON J. The Maillard reaction in food; a critical review from the nutritional standpoint[J]. Progress in Food Nutrition Science, 1981, 5(1/6)： 5-35.

[18] 吳惠玲, 王志強(qiáng), 韓春, 等. 影響美拉德反應(yīng)的幾種因素的研究[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2010, 26(5)： 441-444.

[19] JING H, KITTS D D. Chemical and biochemical properties of caseinsugar Maillard reaction products[J]. Food and Chemical Toxicology, 2002, 40： 1007-1015.

[20] 周潔瑾, 張列兵, 梁建芬, 等. 熱處理對牛乳蛋白質(zhì)品質(zhì)的影響[J]. 食品科技, 2010, 35(6)： 74-77.