熊 亞，李敏杰，覃 懿

(1.攀枝花學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，四川攀枝花617000;2.攀枝花市干熱河谷特色生物資源工程技術(shù)中心，四川攀枝花617000;3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)資環(huán)學(xué)院，四川雅安625000)

石榴是石榴科植物石榴的果實(shí)，又名安石榴、丹若、金嬰、天漿等。成熟的石榴皮色鮮紅或粉紅，常會(huì)裂開，露出晶瑩如寶石般的子粒，酸甜多汁，回味無窮［1］。石榴汁中含有豐富營養(yǎng)物質(zhì)，如維生素、礦物質(zhì)、碳水化合物以及人體必需的多種微量元素［2］。研究表明石榴的營養(yǎng)成分如下:含糖量:7.5% ～11.8%，可溶性固體物:16%，總酸:2.24%～5.5%，還有蛋白質(zhì)、維生素C 和豐富的礦物質(zhì)元素和17 種必需氨基酸，其中含鈣、鐵、磷的量很高，對(duì)于健康起著重要作用［3］。石榴果食用較不方便，將其加工為具有較高附加值且保留其營養(yǎng)成分的果酒產(chǎn)品，不僅可以增加農(nóng)民收入，還可以減少運(yùn)輸、儲(chǔ)存過程中的損失，擴(kuò)大石榴的銷路。同時(shí)由于石榴酒在加工、銷售、儲(chǔ)存過程中容易發(fā)生褐變，嚴(yán)重影響了石榴酒的感官質(zhì)量，也將嚴(yán)重影響其經(jīng)濟(jì)效益。根據(jù)前人的研究，影響褐變的因素可分為:酶促褐變和非酶促褐變［4］。酶促褐變:是在有氧的條件下，酚酶催化酚類物質(zhì)形成醌及其聚合物的反應(yīng)過程。非酶促褐變:研究表明含有酚酸(主要有表兒茶素的衍生物、兒茶素、沒食子酸、咖啡酸、花青素)和鄰羥基酚結(jié)構(gòu)的類黃酮在石榴酒的褐變機(jī)制中很重要，其中黃烷-3-醇衍生物被科學(xué)家認(rèn)為是非酶促氧化褐變最有用的基質(zhì)，它的含量與褐變程度有重要的關(guān)系［5］。所以，石榴酒褐變主要是氧化褐變。本實(shí)驗(yàn)以石榴為原料生產(chǎn)發(fā)酵果酒，主要對(duì)石榴果酒的生產(chǎn)工藝進(jìn)行優(yōu)化，也對(duì)石榴酒的氧化褐變的抑制進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

石榴 采自四川省攀枝花市仁和區(qū)大田鎮(zhèn);果膠酶 江蘇銳陽生物科技有限公司，酶活:30 萬U;安琪葡萄酒高活性干酵母 安琪酵母股份有限公司，酵母數(shù)量:1 ×1010個(gè)/g。

BL610 電子天平 上海精天電子儀器有限公司;托盤天平 榮成市晟博機(jī)械公司、10609CHO 手持折光儀 鄭州南北儀器設(shè)備公司;電爐 寧波東方公司，752 型紫外可見分光光度計(jì) 上海恒平科學(xué)儀器有限公司;冰箱 青島海爾股份有限公司產(chǎn)品;BM255 果汁機(jī) 美的集團(tuán)有限公司。

1.2 工藝流程

1.3 分析檢測方法

酒精度的測定:蒸餾法［6］;總酸(以檸檬酸計(jì))含量的測定:滴定法;揮發(fā)酸(以醋酸計(jì))含量的測定:蒸餾法;總糖含量的測定:斐林試劑法;細(xì)菌總數(shù)的測定:稀釋平板計(jì)數(shù)法;大腸菌群:乳糖膽鹽發(fā)酵法［7］。透光率的測定:分光光度法。

1.4 工藝要點(diǎn)

選料:選擇新鮮完好、成熟度較高的石榴，首先看品種，一般是黃色的最甜。其次看光澤，如果光滑到發(fā)亮那說明石榴新鮮的，表面如果有黑斑的話，則說明不新鮮了。再次拈重量了，較重的是熟透了的，里面水分會(huì)比較多。最后看石榴的皮是不是很飽滿，就是皮和里面的肉很緊繃的那樣，否則就代表石榴不新鮮了。

去皮:將成熟的石榴剝?nèi)ネ馄ぃü庵g的黃色組織，人工去皮，去皮時(shí)并應(yīng)去凈爛肉、斑點(diǎn)。

榨汁:將去皮后的石榴進(jìn)行榨汁，榨汁時(shí)不能加過多的水，加水量控制在10%～20%，同時(shí)加入亞硫酸和果膠酶［8］。

酶解:石榴果實(shí)中含有大量果膠，會(huì)影響石榴籽的出汁率，所以在榨汁時(shí)添加果膠酶，可提高酶解效率［9］，以除去果膠。添加果膠酶后，在常溫下進(jìn)行攪拌澄清，并靜置24 小時(shí)，在過濾后測得石榴籽和殘?jiān)亓靠傻贸鲋省?/p>

過濾:將石榴汁用紗布過濾(過濾前應(yīng)用亞硫酸對(duì)紗布進(jìn)行清洗)濾去石榴籽及殘?jiān)?/p>

糖酸調(diào)整:根據(jù)石榴原汁中的含糖的多少可按比例加入白砂糖，將果汁的糖度調(diào)至20Bx，pH 控制在3.5～4.5［10］。

發(fā)酵:將活化的安琪葡萄酒高活性干酵母接入石榴汁中進(jìn)行酒精發(fā)酵。在發(fā)酵過程要檢測各種參數(shù)以監(jiān)測發(fā)酵是否順利進(jìn)行，主要的參數(shù)有溫度、糖度、比重、酸度。起酵后，以醪液的比重判斷發(fā)酵進(jìn)行的程度，當(dāng)比重下降到1.000 以下后，檢測糖度，當(dāng)糖度在4g/L 以下，加入100mg/kg 亞硫酸終止發(fā)酵。并檢測果酒酒精度。

澄清:發(fā)酵結(jié)束后靜置澄清1 周。

過濾:澄清結(jié)束后將酒液倒罐，并將底部沉淀進(jìn)行過濾。

1.5 單因素實(shí)驗(yàn)

果酒發(fā)酵是經(jīng)過一系列酶的催化作用把發(fā)酵液中的糖轉(zhuǎn)化為CO2、酒精以及其他代謝產(chǎn)物，給予果酒獨(dú)特風(fēng)味的過程。其中發(fā)酵溫度，二氧化硫的添加量和酵母接種量都對(duì)發(fā)酵結(jié)果有直接的影響，所以分別進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。根據(jù)酵母的適宜生長溫度范圍，我們選取20～28℃為溫度因素的實(shí)驗(yàn)范圍，當(dāng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)固定另外2 個(gè)因素條件，根據(jù)前人研究的結(jié)果我們選取二氧化硫的添加量為60mg/kg，接種量為4%。以發(fā)酵后果酒的酒精度為指標(biāo)，得出某溫度值為最優(yōu)值。然后以此溫度，接種量4% 為固定值，對(duì)二氧化硫的添加量做單因素實(shí)驗(yàn)，得出二氧化硫添加量為多少時(shí)為最優(yōu)值。同理，可得接種量的最優(yōu)值。

1.6 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

由圖1～圖3 可得，以發(fā)酵溫度(℃)、二氧化硫(mg/kg)和酵母菌接種量(%，體積分?jǐn)?shù))為三個(gè)因素，并選取各自最佳值相近的三水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)［11］(見表1)，以發(fā)酵結(jié)束后的酒精度(%)為驗(yàn)證指標(biāo)。

1.7 石榴酒褐變的控制

褐變控制方法有:添加適合的抗氧化劑;降低氧化底物含量;降低溶氧濃度;改變催化氧化的條件。在本次實(shí)驗(yàn)中，我們采用降低氧化底物含量方法來抑制褐變，主要是采用加入不同澄清劑的方法實(shí)驗(yàn)澄清效果，得出最佳的澄清劑。選取明膠、PVPP、硅藻土為澄清劑進(jìn)行比較，結(jié)合前人研究用量為0.04%和0.08%。

表1 果酒發(fā)酵正交實(shí)驗(yàn)Table 1 Orthogonal test of liquor fermentation

2 結(jié)果及分析

2.1 酶解對(duì)出汁率的影響

由表2 可知，在果膠酶用量為40mg/kg 時(shí)，石榴籽出汁率最高。

表2 酶解對(duì)出汁率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 the results of juice yield on Enzymatic Hydrolysis

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

考查發(fā)酵溫度因素對(duì)石榴酒酒精度的影響時(shí)，固定另外2 個(gè)因素條件，即二氧化硫的添加量為60mg/kg，接種量為4%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。根據(jù)圖1可知，最優(yōu)發(fā)酵溫度為24℃。考查二氧化硫添加量對(duì)石榴酒酒精度的影響，得圖2。由圖2 可知二氧化硫最佳添加量為50mg/kg。根據(jù)圖3 可知，最佳接種量為5%。

圖1 發(fā)酵溫度對(duì)果酒酒精度的影響Fig.1 Impact of the fermentation temperature on the alcoholic strength of liquor

圖2 二氧化硫添加量對(duì)果酒酒精度的影響Fig.2 Impact of the amount of SO2 on the alcoholic strength of liquor

圖3 接種量對(duì)果酒酒精度的影響Fig.3 Impact of inoculum size on the alcoholic strength of liquor

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及方差分析見表3、表4。從表3中可見，石榴酒發(fā)酵的正交實(shí)驗(yàn)中，R1＞R2＞R3，即發(fā)酵溫度對(duì)果酒的酒精度影響最大，其次是二氧化硫添加量，再次是接種量。最優(yōu)組合是A2B2C2，即發(fā)酵溫度為24℃，二氧化硫添加量50mg/kg，酵母接種量為5%。由表5 可以看出，發(fā)酵溫度的F 值達(dá)到顯著水平，即發(fā)酵溫度的影響具有顯著性。

2.3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證

由于從實(shí)驗(yàn)得到的最佳工藝條件組合(A2B2C2)并未包括在正交表的9 個(gè)實(shí)驗(yàn)內(nèi)，為了進(jìn)一步確定結(jié)果，在最佳發(fā)酵條件即發(fā)酵溫度為24℃，二氧化硫添加量50mg/kg，酵母接種量為5% 下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得發(fā)酵酒精度為9.9%的石榴果酒(實(shí)驗(yàn)號(hào)10)。與正交實(shí)驗(yàn)中最優(yōu)實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)5 號(hào)進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果見表5。由表5 可知，最佳發(fā)酵條件下的石榴果酒品質(zhì)最好。

表3 發(fā)酵正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of orthogonal test

表4 方差分析結(jié)果Table 4 Results of variance analysis

表5 正交實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果Table 5 Confirmatory results of orthogonal test

2.5 石榴酒褐變的研究及控制

以明膠、PVPP、硅藻土為澄清劑進(jìn)行比較，結(jié)果見表6。

表6 不同澄清劑對(duì)果酒澄清度的影響Table 6 Impact of different clarifiers on the liquor

由表6 可見，相同添加量時(shí)硅藻土的澄清效果最好。再通過不同硅藻土用量的實(shí)驗(yàn)，確定最佳用量。由表7 可以看出，當(dāng)硅藻土添加量為0.10%時(shí)，透光率最高，也就是酒液澄清度最佳。

石榴酒存儲(chǔ)過程中褐變的周期較長，一般采用加速褐變的方法使其快速發(fā)生褐變，以研究澄清劑對(duì)褐變的影響。氧化破敗實(shí)驗(yàn)是在50mL 燒杯中加入25mL 石榴酒，放置在室溫下的空氣中5 天，測得透光率的變化可反映酒液褐變程度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表8。由表8 可知，經(jīng)過澄清劑處理的石榴酒，其褐變程度得到大幅度的抑制。

表7 硅藻土對(duì)果酒澄清度的影響Table 7 Influence of the diatomite on the clarity of liquor

表8 氧化對(duì)果酒澄清度的影響Table 8 Impact of oxidation on the liquor

2.6 成品品質(zhì)

2.6.1 感官指標(biāo) 色澤:淡紅色，色澤鮮艷;澄清度:澄清透明，無沉淀及懸浮物;香味:具有濃郁的酒香和石榴特有的芳香氣，香氣柔和，無異味;口味:酸味柔和爽口，滋味純正，酸甜協(xié)調(diào)。

2.6.2 理化指標(biāo) 總糖(以葡萄糖計(jì))2.5g/L，固形物24.7g/L，酒精度9.9%，總酸(以檸檬酸計(jì))2.7g/L，揮發(fā)酸(以醋酸計(jì))0.09g/L，pH3.6，總SO2146mg/L，游離SO228mg/L。

2.6.3 微生物指標(biāo) 果酒細(xì)菌總數(shù)≤35.00 個(gè)/mL;大腸桿菌和致病菌未檢出。產(chǎn)品符合GB/T 15038-2006 標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)酵溫度為24℃，二氧化硫添加量50mg/kg，酵母接種量為5%時(shí)，乙醇的濃度可以達(dá)到9.9%，是發(fā)酵石榴果酒的最佳生產(chǎn)工藝條件。其中發(fā)酵溫度的影響最大，其次是二氧化硫添加量。石榴籽的處理中添加40mg/kg 的果膠酶可以得到最大的出汁率。

石榴酒的褐變對(duì)石榴酒的色澤產(chǎn)生嚴(yán)重的影響，同時(shí)也影響了石榴酒的經(jīng)濟(jì)效益。石榴酒中添加0.10%的硅藻土，可使酒液澄清度最佳，同時(shí)也可抑制其褐變。

［1］濮智穎，翟文俊，楊春霞，等.全發(fā)酵石榴酒的營養(yǎng)價(jià)值和保健作用［J］.食品科技，2007(8):278-281.

［2］吳連軍，于玲.SO2對(duì)石榴酒發(fā)酵的影響研究［J］.釀酒，2007(2):72-74.

［3］杜琨，劉釗.低度石榴果酒的生產(chǎn)工藝［J］.釀酒科技，2006(11):81-82.

［4］李任強(qiáng)，江鳳儀，方玲，等.維生素C 與氨基酸褐變反應(yīng)的研究［J］.食品工業(yè)科技，2002，23(11):32-34.

［5］莊惠婷，杜金華，郭春寶，等.發(fā)酵石榴酒的色澤變化［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2011(3):113-117.

［6］中國標(biāo)準(zhǔn)出版社第一編輯室.中國食品工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)匯編(飲料酒卷)［M］.北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出社，1996.

［7］張正奇.分析化學(xué)［M］.北京:科學(xué)出版社，2006.

［8］王成榮，周山濤.果膠酶制劑在澄清石榴汁加工中的應(yīng)用研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，1990(5):29-35.

［9］蔣依輝，林秉斌，吳潔芳，等.澄清型番木瓜柑桔復(fù)合果汁的研制［J］.食品工業(yè)科技，2008，29(9):179-181.

［10］艾啟俊，張德權(quán).果品深加工新技術(shù)［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2004.

［11］明道緒.生物統(tǒng)計(jì)附實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)［M］.中國農(nóng)業(yè)出版社，2004.