袁海曉，鐘桂芳，樊 攀，魏東芝，楊雪鵬

(鄭州輕工業(yè)學(xué)院，食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州450003)

脂肪酶(EC3.1.1.3，又稱三酰基甘油水解酶)是一種特殊的酯鍵水解酶，它能在油水界面催化天然底物(油脂)水解，生產(chǎn)甘油和脂肪酸［1］。脂肪酶是一種重要的工業(yè)酶類，廣泛應(yīng)用于食品、洗滌、皮革、造紙、醫(yī)藥等行業(yè)［2］，尤其是該酶可以耐受有機溶劑，在有機合成中具有廣泛的應(yīng)用潛力［3］。我國微生物脂肪酶的研究和開發(fā)工作始于60 年代，但主要是中性脂肪酶，近年來隨著環(huán)保意識的增強，無磷洗滌劑開始普及，堿性脂肪酶的研究逐漸成為熱點［4］。脂肪酶來源于動物、植物和微生物，微生物脂肪酶比動植物脂肪酶更具有潛力和優(yōu)勢。據(jù)統(tǒng)計，自然界中有65 個屬的微生物能產(chǎn)脂肪酶，報道的主要有黑曲霉、毛霉、假單胞菌等［5］。假單胞菌產(chǎn)的脂肪酶具有耐熱、耐堿等特點，可在有機相中催化多種反應(yīng)，應(yīng)用潛力大［6］。本課題組篩到的一株產(chǎn)堿性脂肪酶的細菌經(jīng)鑒定是假單胞菌，本文對已分離得到的BL11 菌株的產(chǎn)酶條件進行優(yōu)化，以期為進一步研究堿性脂肪酶的發(fā)酵生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

假單胞菌BL11 由鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院酶分子工程研究室保藏;種子培養(yǎng)基 酵母粉0.5%，蛋白胨1%，氯化鈉1%，pH7.0;基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基 麥芽糖1%，蛋白胨1%，K2HPO40.2%，pH7.5;蛋白胨，酵母粉，麥芽糖，K2HPO4等藥品 均為分析純。

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北京市長風(fēng)儀器儀公司;UV-2600 紫外可見分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發(fā)酵培養(yǎng)及制備粗酶液 挑取BL11 單菌落接種于種子培養(yǎng)基，37℃，200r/min 振蕩過夜后按2%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，37℃，200r/min 培養(yǎng)48h 后，4℃、7000r/min 離心15min，收集發(fā)酵上清即為粗酶液。

1.2.2 酶活測定［7］本實驗采用分光光度法測定脂肪酶酶活。以pH8.0，60℃條件下，每分鐘分解底物(對硝基苯酚十二烷酸酯)釋放1μmol 對硝基苯酚所需酶量定義為1 個堿性脂肪酶酶活力單位(U)，用U/mL 表示。

1.2.3 BL11 菌株產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

1.2.3.1 單因素實驗 單因素條件包括碳源、氮源、誘導(dǎo)劑、無機鹽、起始pH、裝液量、溫度、轉(zhuǎn)速、發(fā)酵時間。所有實驗均設(shè)置3 個平行，實驗數(shù)據(jù)采用DPS統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析。

1.2.3.2 均勻設(shè)計 在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用均勻設(shè)計進一步優(yōu)化培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件。共選擇4 個因素，每個因素設(shè)5 個水平，采用均勻設(shè)計表U5(54)優(yōu)化(見表1)。其他培養(yǎng)條件為K2HPO40.2%，裝液量 40mL/250mL 三角瓶，搖床轉(zhuǎn)速180r/min，發(fā)酵時間60h。

表1 U5(54)均勻表Table 1 U5(54)uniform design table

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗優(yōu)化發(fā)酵參數(shù)

2.1.1 碳源對BL11 產(chǎn)酶的影響 考察葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、淀粉、糊精對BL11 產(chǎn)酶的影響。采用基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，分別選1%不同種類的碳源，37℃、200r/min 培養(yǎng)48h 后測定脂肪酶酶活。結(jié)果如圖1，麥芽糖為碳源時酶活最高，故選用麥芽糖作碳源。進一步考察不同麥芽糖濃度對BL11 產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見圖2 所示，當麥芽糖濃度為1%時，脂肪酶酶活最高。

圖1 碳源對BL11 產(chǎn)酶的影響Fig.1 Effect of carbon sources on lipase production produced by BL11

2.1.2 氮源對BL11 產(chǎn)酶的影響 以1%麥芽糖為唯一碳源，選用牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、NaNO3、尿素、(NH4)2SO4為氮源，其他營養(yǎng)成分同前，實驗結(jié)果如圖3 所示，選用蛋白胨時酶活達到最高，進一步優(yōu)化其濃度，結(jié)果如圖4 所示，當其濃度為2%時，脂肪酶酶活最高。

圖2 麥芽糖濃度對BL11 產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effect of maltose concentration on lipase production produced by BL11

圖3 氮源對BL11 產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effect of nitrogen sources on lipase production produced by BL11

圖4 蛋白胨濃度對BL11 產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effect of nitrogen concentration on lipase production produced by BL11

2.1.3 誘導(dǎo)劑對BL11 產(chǎn)酶的影響 向部分優(yōu)化培養(yǎng)基中添加0.2%橄欖油、豆油、花生油、玉米油和葵花籽油考察誘導(dǎo)劑對BL11 產(chǎn)酶的影響。結(jié)果如圖5所示，不同種類的誘導(dǎo)劑均可以不同程度地提高酶活?？疾於褂蜐舛葘Ξa(chǎn)酶的影響，結(jié)果如圖6 所示，當豆油濃度為0.2%時，BL11 菌株的產(chǎn)酶情況最佳，故選用0.2%豆油作為誘導(dǎo)劑。

2.1.4 無機鹽離子對BL11 產(chǎn)酶的影響 向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.2%不同種類的無機鹽，其對BL11 產(chǎn)酶的影響見圖7。從圖7 可看出，與對照(不添加任何鹽)相比，只有K+可促進產(chǎn)酶;進一步優(yōu)化其最適產(chǎn)酶濃度，從圖8 可知，當K2HPO4濃度為0.2%時，BL11 產(chǎn)酶能力達到最佳。

2.1.5 起始pH 對BL11 產(chǎn)酶的影響 配制不同起始pH(6～9)的發(fā)酵培養(yǎng)基，37℃、200r/min 發(fā)酵48h 后測脂肪酶酶活。由圖9 可知，BL11 菌株的最適產(chǎn)酶pH為7.5，較接近中性，pH 偏酸偏見都不利于其產(chǎn)酶。

圖5 誘導(dǎo)劑對BL11 產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of inducers on lipase production produced by BL11

圖6 豆油濃度對BL11 產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effect of soybean oil concentration on lipase production produced by BL11

圖7 無機鹽對BL11 產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effect of inorganic salts on lipase production produced by BL11

圖8 K2HPO4 濃度對BL11 產(chǎn)酶的影響Fig.8 Effect of K2HPO4 concentration on lipase production produced by BL11

圖9 起始pH 對BL11 產(chǎn)酶的影響Fig.9 Effect of initial pH on lipase production produced by BL11

2.1.6 裝液量(溶氧)對BL11 產(chǎn)酶的影響 裝液量反映了菌株對溶氧的要求，溶氧對BL11 產(chǎn)酶的影響見圖10。從圖10 可知，裝液量為20mL/250mL 時酶活達到最高，裝液量為20、30、40mL/250mL 時酶活相差無幾，考慮培養(yǎng)基的利用效率，裝液量采用40mL/250mL。

圖10 裝液量對BL11 產(chǎn)酶的影響Fig.10 Effect of loaded liquid on lipase production produced by BL11

2.1.7 溫度對BL11 產(chǎn)酶的影響 選取26、28、30、32、34、37℃不同溫度，200r/min 培養(yǎng)48h 后測定酶活。結(jié)果見圖11 所示，BL11 在30℃培養(yǎng)時脂肪酶酶活達到最大。

圖11 溫度對BL11 產(chǎn)酶的影響Fig.11 Effect of temperature on lipase production produced by BL11

2.1.8 轉(zhuǎn)速對BL11 產(chǎn)酶的影響 BL11 菌株發(fā)酵培養(yǎng)搖床轉(zhuǎn)速分別設(shè)置為160、180、200、220r/min，30℃培養(yǎng)48h 后測定酶活，從圖12 可知，當搖床轉(zhuǎn)速為180r/min 時，BL11 菌株所產(chǎn)脂肪酶酶活達到最大。

2.1.9 培養(yǎng)時間對BL11 產(chǎn)酶的影響(產(chǎn)酶曲線)BL11 菌株產(chǎn)酶曲線如圖13 所示，隨著發(fā)酵時間延長，BL11 菌產(chǎn)脂肪酶酶活也呈現(xiàn)先升后降的趨勢，當發(fā)酵時間為60h 時，脂肪酶酶活達到最大。

圖12 轉(zhuǎn)速對BL11 產(chǎn)酶的影響Fig.12 Effect of rotate speed on lipase production produced by BL11

圖13 發(fā)酵時間對BL11 產(chǎn)酶的影響Fig.13 Effect of fermentation time on lipase production produced by BL11

2.2 均勻設(shè)計優(yōu)化發(fā)酵參數(shù)

利用單因素方差分析法分析上述實驗結(jié)果，按其對BL11 產(chǎn)酶影響的顯著性進行排序。選取影響產(chǎn)酶顯著的四個因素進行均勻設(shè)計優(yōu)化發(fā)酵參數(shù)。選取的四個因素為麥芽糖、蛋白胨、豆油、溫度，每個因素取5 個水平，選用均勻?qū)嶒灡鞺5(54)進行實驗，結(jié)果見表2。

表2 均勻?qū)嶒灲Y(jié)果Table 2 the result of uniform design

通過DPS 軟件回歸分析，得到酶活大小(Y)與各因素(X)之間的關(guān)系方程為

Y =217.02 +1.99X1-266.2X2+84X22，相關(guān)系數(shù)R =0.9998，F(xiàn) =982.1788，p =0.0235。

各因素的最佳組合為:麥芽糖2.5%，蛋白胨3.0%，豆油0.5%，溫度33℃，理論酶活可達到228.28 U/mL。根據(jù)DPS 軟件回歸分析的結(jié)果，進行驗證實驗，發(fā)酵上清最終酶活為223U/mL，略低于理論值。

3 結(jié)論與討論

通過單因素實驗和均勻設(shè)計相結(jié)合的方法獲得了假單胞菌BL11 菌株液體發(fā)酵最佳培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件。最佳培養(yǎng)基配方為:麥芽糖2.5%，蛋白胨3.0%，豆油0.5%，K2HPO40.2%;培養(yǎng)條件為起始pH7.5，裝液量40mL/250mL 三角瓶，培養(yǎng)溫度33℃，搖床轉(zhuǎn)速180r/min。在該培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，振蕩培養(yǎng)60h，脂肪酶活力可達223U/mL。通過均勻設(shè)計優(yōu)化后酶活較之單因素實驗最大酶活提高了30%，較大地提高了酶活且簡化了實驗。

脂肪酶活力測定方法主要有滴定法、對硝基苯酚法和銅皂法，對硝基苯酚法比滴定法結(jié)果穩(wěn)定、重復(fù)性好，比銅皂法安全且用時短，是快速測定脂肪酶活力的較好選擇。

不同油脂作為誘導(dǎo)劑均可使假單胞菌BL11 產(chǎn)酶酶活有不同程度地提高，六種油脂中以豆油的效果最佳。

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