張雅麗，李建科 ，劉 柳

( 陜西師范大學食品工程與營養(yǎng)科學學院，陜西西安710062)

沒食子酸(Gallic acid)，為3，4，5-三羥基苯甲酸，分子式為C7H6O5，分子量為170.12，通常以一水合物的狀態(tài)存在，是白色或微黃色針狀晶體，是一種天然的多酚類化合物。它以游離酸形式或形成酯類化合物存在于五倍子、茶、沒食子等植物中，是植物體中一類次生代謝產(chǎn)物，屬于低毒物質(zhì)，可用于醫(yī)藥、有機合成和食品、農(nóng)業(yè)、礦產(chǎn)等領域［1］。食品是人類生存的基礎物質(zhì)，隨著社會經(jīng)濟發(fā)展、生活水平的提高，人們越來越重視對食品污染菌的控制。國內(nèi)外對沒食子酸的生物活性研究涉及抗氧化、抗腫瘤、抗突變等［2-4］。有報道證實［5］沒食子酸在體外對金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門菌等具有很好的抑制作用，但從食品安全角度對其抑菌作用的研究報道少且不系統(tǒng)。本文以食品中常見食源性致病菌和腐敗菌為供試菌，研究了沒食子酸的體外抑菌活性，并通過掃描電鏡觀察了高敏感菌的形態(tài)結構的變化，為沒食子酸抑菌機制的深入研究及應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸桿菌(Escherichia coli)，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，單增李斯特菌(Listeria monocytogenes)，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtillis)，蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)，巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)，以上菌株均由陜西師范大學食品工程與營養(yǎng)科學學院功能食品與安全實驗室提供;蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂均為國產(chǎn)生化試劑;氯化鈉、氫氧化鈉、沒食子酸(一水)均為國產(chǎn)分析純。

LDZX-30KBS 立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;SPX 智能型生化培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠;THZ-D 型臺式恒溫震蕩器 太倉市實驗設備廠;680 型酶標儀 美國伯樂公司;YJ-HS-1 單人水平型潔凈工作臺 蘇凈集團安泰公司;牛津杯 內(nèi)徑(6.0 ±0.1)mm，外徑(7.8 ±0.1)mm;Quanta200 型環(huán)境掃描電子顯微鏡 FEI 公司。

1.2 實驗方法

表1 沒食子酸對各菌的最小抑菌濃度Table 1 The minimal inhibitory concentration of Gallic acid on different pathogens

1.2.1 LB 培養(yǎng)基［6］液體培養(yǎng)基:蛋白胨1g、酵母浸粉0.5g、氯化鈉1g，蒸餾水100mL，調(diào)pH7.3;固體培養(yǎng)基中加2g 瓊脂粉，其它同上;121℃高壓滅菌20min。

1.2.2 活化菌種及制備菌懸液［7］將保存在試管斜面培養(yǎng)基上的菌種，通過劃線法接種于LB 固體平板上，37℃培養(yǎng)24h，連續(xù)培養(yǎng)兩代;取活化后的單菌落接種于5mL LB 液體培養(yǎng)基中，37℃、110r/min 培養(yǎng)16h，并以LB 液體培養(yǎng)基稀釋菌液濃度為105CFU/mL作為供試菌菌懸液，備用。

1.2.3最小抑菌濃度 (minimal inhibitory concentration，MIC)的測定［8］采用液體二倍稀釋法，用LB 液體培養(yǎng)基將沒食子酸制成終濃度分別為4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625mg/mL 的溶液;各取5mL 做為實驗組，以不加沒食子酸的LB 培養(yǎng)基為對照組，分 別 加 入 200μL 供 試菌 菌 懸 液，37℃、110r/min培養(yǎng)24h，以肉眼觀察，沒有變渾濁的最低濃度為沒食子酸對該菌的最小抑菌濃度，每組重復3 次。

1.2.4 抑菌活性測定［9］采用牛津杯法。取各供試菌菌懸液200μL 于對應瓊脂平板上，涂布均勻，每個平板上放2 個牛津杯，一個加入200μL 沒食子酸溶液，另一個加LB 液體培養(yǎng)基作為對照組。將平板置于37℃恒溫培養(yǎng)24h 后測抑菌圈直徑，每組重復3次，取平均值。

1.2.5 對生長曲線的影響［10］用LB 液體培養(yǎng)基將沒食子酸制成終濃度分別為1/2MIC、1 倍MIC 的溶液，各取5mL 做為實驗組，以不加沒食子酸的LB 培養(yǎng)基為對照組，分別加入200μL 供試菌菌懸液，在37℃、110r/min 條件下連續(xù)培養(yǎng)，每隔2h 用酶標儀測定OD630nm值，直到各菌生長達到穩(wěn)定期，每組重復3 次，取平均值，制作OD630nm-t 生長曲線。

1.2.6 用掃描電鏡觀察對單增李斯特菌形態(tài)的影響［11］以加入1 倍MIC 濃度的沒食子酸組為實驗組，以不加沒食子酸的為對照組。兩組各取5mL，分別加200μL 單增李斯特菌菌懸液，37℃、110r/min 培養(yǎng)12h，隨后按以下步驟分別處理實驗組與對照組。在4000r/min 離心10min 收集菌體，在2.5%戊二醛溶液中4℃固定過夜，0.2mol/L pH7.2 磷酸鹽緩沖液洗兩次以洗去殘存的戊二醛，分別用40%、70%、90%、100%(v/v)不同濃度的乙醇對菌體進行脫水處理各15min，然后將菌體涂在載玻片上，自然晾干，噴金，用掃描電鏡進行觀察。

2 結果與分析

2.1 抑菌效果的研究

由表1 可知，沒食子酸對供試菌都有抑制效果。對單增李斯特菌的抑菌效果最好，MIC 為0.125mg/mL;對大腸桿菌次之，MIC 為0.25mg/mL;對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌的效果較弱，MIC 分別為2、4、4、4mg/mL。最小抑菌濃度可作為評價抑菌物質(zhì)體外抑菌活性強弱的指標，MIC 值越小，說明該物質(zhì)對此菌的抑制能力越強。許維國等［5］研究結果顯示沒食子酸對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌具有抑制作用，尤其對鼠傷寒沙門菌效果好。鄭曙明等［1］研究了沒食子酸對柱狀黃桿菌、溫和氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌和遲緩愛德華菌4 種水產(chǎn)動物致病菌的體外抑菌作用，其中遲緩愛德華菌表現(xiàn)出較高的敏感性。本實驗所用供試菌雖與上述研究中的不完全相同但都表明沒食子酸具有很好的抑菌作用。

2.2 抑菌活性的研究

由表2 可知，沒食子酸對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌6 種菌的抑菌圈直徑分別為20.67 ±0.28、17.17 ±0.64、24.03 ±0.17、14.43 ±0.10、14.77 ±0.04、(15.07 ±0.03)mm。各菌均對沒食子酸表現(xiàn)出不同的敏感性，其中單增李斯特菌最敏感、抑菌圈最大，大腸桿菌次之。因此在后面實驗中，本文只用掃描電鏡觀察了沒食子酸對高敏感菌單增李斯特菌形態(tài)的影響。并且沒食子酸對枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌所產(chǎn)生的抑菌圈略有差異，3者中巨大芽孢桿菌抑菌圈最大。

表2 沒食子酸對各菌的抑菌活性Table 2 The antibacterial activity of Gallic acid on different pathogens(mm)

2.3 對生長曲線的影響的研究

細菌懸液的光密度可反映出細菌濃度的大小，并進一步體現(xiàn)細菌的生長情況。如圖1～圖6 所示，對照組均呈現(xiàn)細菌典型的生長曲線，而加入1 倍MIC和1/2MIC 濃度的沒食子酸后，細菌的生長曲線均有不同程度的改變。圖1 中，1 倍MIC 濃度處理組中，大腸桿菌生長緩慢，與對照組相比，沒食子酸主要抑制了其對數(shù)生長期的菌體分裂;而1/2MIC 濃度處理組中菌體雖進入對數(shù)生長期，但由于沒食子酸的抑制作用，其OD630nm值小于對照組。圖2～圖6 中，1 倍MIC 濃度處理組中，各菌生長曲線都處于較低狀態(tài)，但金黃色葡萄球菌在14h 后出現(xiàn)生長現(xiàn)象，可能是由于沒食子酸被逐漸消耗，致使抑制效果持續(xù)時間短［10］，而蠟狀芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌都能被很好的抑制;1/2MIC 濃度處理組中各菌體在沒食子酸作用下OD630nm值均小于對照組。圖3 中，經(jīng)1 倍MIC 濃度處理的單增李斯特菌生長緩慢，不能進入對數(shù)生長期;而1/2MIC 濃度處理組中，菌體在10h 前生長緩慢，此后迅速生長，可能與沒食子酸濃度低有關［12］。

圖1 沒食子酸對大腸桿菌生長的影響Fig.1 Effect of Gallic acid on Escherichia coli growth

圖2 沒食子酸對金黃色葡萄球菌生長的影響Fig.2 Effect of Gallic acid on Staphylococcus aureus growth curve

2.4 掃描電鏡觀察對單增李斯特菌形態(tài)影響的結果

由圖7 可知，未經(jīng)處理的對照組中A 單增李斯特菌形態(tài)完整、兩端圓鈍，呈現(xiàn)桿狀，并且表面圓潤、光滑，較分散，細胞間邊界明顯;而實驗組B 中，菌體從中間處凹陷，大部分出現(xiàn)破損，具有明顯的細胞原生質(zhì)泄漏現(xiàn)象，致使細胞結成一團?？梢姏]食子酸對菌體細胞具有損傷破壞作用，但是不能明確說明沒食子酸與菌體細胞的結合位點，這有待進一步研究。

圖3 沒食子酸對單增李斯特菌生長的影響Fig.3 Effect of Gallic acid on Listeria monocytogenes growth curve

圖4 沒食子酸對枯草芽孢桿菌生長的影響Fig.4 Effect of Gallic acid on Bacillus subtillis growth curve

圖5 沒食子酸對蠟狀芽孢桿菌生長的影響Fig.5 Effect of Gallic acid on Bacillus cereus growth curve

圖6 沒食子酸對巨大芽孢桿菌生長的影響Fig.6 Effect of Gallic acid on Bacillus megaterium growth curve

3 討論

圖7 沒食子酸對單增李斯特形態(tài)的影響(A 對照組，B 實驗組)Fig.7 Effect of Gallic acid on the cells of Listeria monocytogenes(A control group，B experimental group)

3.1 從抑菌作用上看，沒食子酸在體外對各供試菌均有較好的抑制作用。有研究顯示，茶多酚產(chǎn)生抑菌作用的分子結構基礎主要是酚羥基［13］。沒食子酸分子結構中含有3 個毗鄰的酚羥基，因此酚羥基可能是沒食子酸產(chǎn)生抑菌作用的活性基團。

3.2 掃描電鏡觀察沒食子酸對單增李斯特菌形態(tài)影響的結果顯示，菌體大部分出現(xiàn)破損，細胞原生質(zhì)泄漏。耿飛等［14］研究烏梅提取液對單增李斯特菌的抑菌機理時發(fā)現(xiàn)，經(jīng)1 倍MIC 濃度的烏梅提取液處理過的單增李斯特菌，細胞膜電位降低、胞內(nèi)Ca2+濃度下降，證實烏梅提取液可作用于單增李斯特菌的細胞膜系統(tǒng)，使其細胞膜裂解、內(nèi)容物泄漏。并且Sitohy 等［15］用透射電鏡觀察大豆球蛋白對單增李斯特菌的影響，發(fā)現(xiàn)被處理過的菌體變形、細胞膜破損。本實驗結果與上述兩者相似，說明沒食子酸可能作用于單增李斯特菌的細胞膜，使其裂解，進而胞內(nèi)物質(zhì)外泄導致菌體死亡。

4 結論

沒食子酸對6 種食品中常見食源性致病菌和腐敗菌在體外具有很好的抑制作用，對單增李斯特菌抑制作用最好;不同濃度沒食子酸對各菌生長曲線都有影響，其OD630nm值均小于對照組，并且濃度增大產(chǎn)生抑制作用增強。掃描電鏡觀察沒食子酸對高敏感菌單增李斯特菌形態(tài)影響的結果顯示，沒食子酸可使菌體從中間處凹陷、大部分出現(xiàn)破損、細胞原生質(zhì)泄漏。綜上所述，沒食子酸在體外具有很好的抑菌作用，期望為沒食子酸的深入開發(fā)和利用及其抑菌機制的研究提供理論基礎，以使其發(fā)揮更大的作用。

［1］鄭曙明，黃建軍，吳青，等.復方五倍子有效成分的分離鑒定及抑菌活性研究［J］.水生生物學報，2010，34(1) ：57-64.

［2］謝曉艷，劉洪濤，張吉，等.沒食子酸體外抗氧化作用研究［J］.重慶醫(yī)科大學學報，2011，36(3) ：319-322.

［3］Kaur M，Velmurugan B，Rajamanickam S，et al.Gallic Acid，an Active Constituent of Grape Seed Extract，Exhibits Antiproliferative，Pro-apoptotic and Anti-tumorigenic Effects Against Prostate Carcinoma Xenograft Growth in Nude Mice［J］.Pharmaceutical Research，2009，26(9) ：2133-2140.

［4］Lacatelli C，Rosso R，Santos-Silva MC，et al.Ester derivatives of gallic acid with potential toxicity toward L1210 leukemia cells［J］. Bioorganic ＆ Medicinal Chemistry，2008，16 ( 7) ：3791-3799.

［5］許維國，劉洋，劉多見，等.沒食子酸抑菌活性分析［J］.中國公共衛(wèi)生，2012，28(10) ：1329-1331.

［6］胡靜，趙小慧，朱春玉，等.槐糖脂對金黃色葡萄球菌的抑菌機理［J］.食品科學，2012，33(5) ：33-36.

［7］馬志宏，李鐵梁，姜娜，等.中草藥對致病性維氏氣單胞菌體外抑菌活性及最優(yōu)組方研究［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2011，38(6) ：155-159.

［8］張文青，龔一富，金思，等.中草藥及其配伍對嗜水氣單胞菌的抑菌作用［J］.漁業(yè)科學進展，2012，33(1) ：114-121.

［9］劉健，王海雁，趙淑江.牛津杯法測定五倍子對大黃魚病原弧菌的體外抑菌活力［J］.海洋科學，2009，33(11) ：44-47.

［10］陳默，胡長鷹，王志偉，等.小腸腸炎耶爾森菌天然抑菌劑的快速篩選［J］.食品工業(yè)科技，2010，31(1) ：112-113，223.

［11］王關林，唐金花，蔣丹，等.苦參對雞大腸桿菌的抑菌作用及其機理研究［J］.中國農(nóng)業(yè)科學，2006，39(5) ：1018-1024.

［12］謝晶，侯偉峰，湯毅，等.植酸對腐敗希瓦氏菌的抑菌機理［J］.食品工業(yè)科技，2011，32(10) ：85-88.

［13］王瑩.茶多酚的抗氧化和抑菌活性及其增效劑［J］.生物學雜志，2007，24(5) ：54-56.

［14］耿飛，王偉，周濤.烏梅提取液對李斯特菌的抑菌機理［J］.食品科學，2011，32(15) ：88-93.

［15］Sitohy MZ，Mahgoub SA，Osman AO.In vitro and in situ antimicrobial action and mechanism of glycinin and its basic subunit［J］.International Journal of Food Microbiology，2012，154(1-2) ：19-29.