陜西省人民醫(yī)院西院二病區(qū)（西安710068） 時(shí) 曄 樊英華 尚 亮 劉延梅 苗 青 高 路

百草枯（Paraquat，PQ）是一種常用的廣譜除草劑，在世界范圍內(nèi)廣泛使用［1］，對(duì)人和動(dòng)物有較強(qiáng)的毒性，其發(fā)病機(jī)制未完全闡明，也無(wú)特效解毒藥物，臨床治療效果差，病死率高達(dá)60%～80%，嚴(yán)重危害著人們的生命健康［2］。

近年研究發(fā)現(xiàn)PQ進(jìn)入機(jī)體后，不僅通過(guò)自由基的脂質(zhì)過(guò)氧化機(jī)制引起組織損傷，還引起炎癥介質(zhì)和炎性因子的釋放，進(jìn)－步加重組織損傷。核因子－κB（Nuclear factor kappa B，NF－κB）是調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)表達(dá)最關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，可介導(dǎo)腫瘤壞死因子－α（TNF－α）等炎性因子生成。有研究發(fā)現(xiàn) NF－κB在全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS）、急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）及多臟器功能衰竭等疾病病理生理方面的重要作用，適當(dāng)抑制NF－κB的活化，能夠下調(diào)炎性介質(zhì)的產(chǎn)生，改善上述疾病過(guò)程中引起的機(jī)體損傷和器官功能衰竭［3］。NF－κB是否調(diào)控炎性因子參與急性PQ中毒腎組織損害，國(guó)內(nèi)目前少見(jiàn)報(bào)道。

材料與方法

1 動(dòng)物分組及模型制備 選擇6周齡健康清潔SD大鼠60只，雄雌各半，體重150～200g（172±15g），購(gòu)于第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。隨機(jī)分三組，每組20只。

對(duì)照組（A組）：1ml生理鹽水腹腔內(nèi)注射；低劑量染毒組（B組）：按15mg／kg將PQ稀釋后腹腔內(nèi)注射；高劑量染毒組（C組）：按30mg／kg將PQ稀釋后腹腔內(nèi)注射。染毒后12h、24h、72h、120h，各組隨機(jī)取5只大鼠處死，右腎制備10%的組織勻漿，左腎10%中性甲醛固定行病理觀察及免疫組化染色。

2 主要試劑 20%PQ溶液（英國(guó)先正達(dá)公司），TNF－α檢測(cè)試劑盒（深圳晶美生物工程公司），EnVision免疫組化檢測(cè)試劑盒（基因科技上海公司），兔抗鼠NF－κB P50多克隆抗體（美國(guó)Santacruz公司 貨號(hào)sc－114）。

3 TNF－α測(cè)定及HE染色 雙抗體夾心酶聯(lián)吸附法測(cè)定勻漿中的TNF－α濃度，HE染色病理觀察（切片厚5μm）。

4 腎組織NF－κB的免疫組化分析 腎組織切片烤片脫蠟后，浸入檸檬酸緩沖液高壓抗原修復(fù)（121℃5min），自然冷卻至室溫。滴加稀釋的一抗（Antibody Diluent稀釋），4℃過(guò)夜。滴加生物素標(biāo)記二抗（Chem Mate En TMVision＋／HRP）工作液，室溫30min，以PBS代一抗作陰性對(duì)照，DAB顯色，肉眼看到棕色立即終止染色，透明及封片，電鏡下觀察陽(yáng)性細(xì)胞。每只大鼠制片5張，光鏡下隨機(jī)選取4個(gè)完整且不重疊高倍視野（×400），以胞漿或胞核出現(xiàn)棕黃色著色顆粒為陽(yáng)性標(biāo)記。判斷結(jié)果采用免疫組織化（Immunohistochemistry score，IHS）標(biāo)準(zhǔn)，分別按陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)及陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)分［4］：A為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比例分級(jí)0（0～1%）、1（1%～10%）、2（10%～50%）、3（50%～80%）、4（80%～100%），B為陽(yáng)性細(xì)胞顯色強(qiáng)度分級(jí)0（陰性）、1（淺黃色為弱陽(yáng)性）、2（淺棕黃色為陽(yáng)性）、3（棕黃色為強(qiáng)陽(yáng)性）；IHS＝A×B。

結(jié) 果

1 大鼠染毒后表現(xiàn)：A組大鼠活動(dòng)靈敏，尿量正常；B組大鼠8～20h出現(xiàn)食欲減退，呼吸急促等；C組大鼠1～3h出現(xiàn)倦怠、嗜睡、煩躁、走路不穩(wěn)、頭顫，食水量明顯減少，呼吸急促，血尿、少尿或無(wú)尿，還有松毛、易捕捉等癥狀。

2 腎功能檢測(cè)結(jié)果：PQ染毒后大鼠出現(xiàn)腎功能損害，且隨染毒劑量和時(shí)間呈正相關(guān)，見(jiàn)表1。

3 腎組織勻漿TNF－α動(dòng)態(tài)變化及其意義：大鼠腎組織TNF－α染毒后12h開(kāi)始逐漸升高，至觀察終點(diǎn)仍處于較高水平，C組明顯高于B組，提示急性PQ中毒早期腎臟炎性損傷過(guò)程中，TNF－α可能起重要作用，見(jiàn)表2。

4 腎臟組織病理學(xué)觀察：A組腎小球及腎小管結(jié)構(gòu)清晰，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，小管內(nèi)無(wú)管型及顆粒（圖1）；B組腎小靜脈及間質(zhì)毛細(xì)血管淤血，小管上皮細(xì)胞腫脹及管腔變窄，72h可見(jiàn)水腫滲出、壞死，間質(zhì)可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖2）；C組早期可見(jiàn)小血管擴(kuò)張淤血，小管上皮腫脹重，包膜張力增大及出血點(diǎn)、淤血，皮髓質(zhì)界限模糊，可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及部分細(xì)胞破壞，管腔內(nèi)有蛋白管型 （圖3）。

5 腎組織NF－κB的表達(dá)，見(jiàn)表3。

表1 三組不同時(shí)間點(diǎn)血清Cr、BUN水平（±s）

表1 三組不同時(shí)間點(diǎn)血清Cr、BUN水平（±s）

注：與A組比較，＊P＜0．05，＊＊P＜0．01

組 別 12h 24h 72h 120h A組 Cr（μmol／L）BUN（mol／L）37．0±1．66 8．7±1．26 36．2±2．67 8．5±1．67 36．4±2．23 8．7±1．23 35．5±1．32 8．5±1．32 B組 Cr（μmol／L）BUN（mol／L）63．5±4．70＊13．5±2．30＊C組 Cr（μmol／L）BUN（mol／L）38．1±2．23 10．8±1．23 39．2±1．21 12．2±1．21＊54．1±3．45＊14．1±2．45＊43．4±2．59＊15．5±2．57＊88．6±6．10＊＊19．6±3．1＊108．4±2．43＊＊25．4±2．43＊＊112．0±5．92＊＊24．0±3．92＊＊

表2 三組不同時(shí)間點(diǎn)腎組織TNF－α水平（μg／L，±s）

表2 三組不同時(shí)間點(diǎn)腎組織TNF－α水平（μg／L，±s）

注：與 A組比較，＊P＜0．05，＊＊P＜0．01，＊＊＊P＜0．001；與B組比較，△P＜0．05，△△P＜0．01

組 別 12h 24h 72h 120h A組 7．34±0．25 6．85±0．64 7．33±0．52 7．40±0．45 B組 10．33±0．48 12．45±0．62＊ 28．46±1．53＊＊ 25．36±1．28＊＊C組 12．40±3．62＊ 22．41±3．78＊＊△ 39．65±4．02＊＊＊△△ 36．65±3．27＊＊＊△△

表3 三組不同時(shí)間點(diǎn)腎組織NF－κB的IHS評(píng)分（±s）

表3 三組不同時(shí)間點(diǎn)腎組織NF－κB的IHS評(píng)分（±s）

注：與 A組比較，＊P＜0．05，＊＊P＜0．01，＊＊＊P＜0．001；與B組比較，△P＜0．05，△△P＜0．01

組 別 12h 24h 72h 120h A組 0．12±0．03 0．05±0．01 0．06±0．02 0．05±0．01 B組 0．47±0．05 1．65±0．12＊ 1．98±0．18＊＊ 2．1±0．25＊＊C組 1．87±0．14＊△ 5．62±0．78＊＊＊△△ 6．96±0．54＊＊＊△△ 8．20±0．82＊＊＊△△

A組NF－κB不表達(dá)或很少表達(dá)，僅見(jiàn)極少數(shù)腎小管細(xì)胞漿棕黃色淡染，各時(shí)間點(diǎn)間無(wú)差異（圖4）；B組NF－κB表達(dá)在12h與A組大鼠無(wú)明顯差異，而在24h、72h、120h表達(dá)增多，并隨時(shí)間延長(zhǎng)呈線性升高趨勢(shì)，至觀察結(jié)束仍保持較高水平，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖5）；C組NF－κB表達(dá)在12h即升高，以后各時(shí)間點(diǎn)隨時(shí)間延長(zhǎng)呈線性升高趨勢(shì)，72h左右達(dá)到高峰且見(jiàn)核表達(dá)。C組NF－κB表達(dá)在12h較A組及B組均有顯著性差異；在24h、72h、120h較A組有非常顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，較B組有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖6）。

結(jié)果提示：急性PQ中毒后腎組織NF－κB表達(dá)較早且非常強(qiáng)烈，尤其在C組，結(jié)合臨床重度中毒者早期發(fā)生腎功能損害比例高，可能有較重要的意義。

討 論

PQ造成機(jī)體損傷是多系統(tǒng)、多器官、多水平的，體內(nèi)的PQ主要以原形從腎臟排出，24h內(nèi)可排出50%～70%。一項(xiàng)關(guān)于PQ中毒薈萃分析［5］，檢索了1994年至2006年國(guó)內(nèi)期刊數(shù)據(jù)庫(kù)公開(kāi)發(fā)表的論文及Medline相關(guān)報(bào)道1069例患者，腎損傷的發(fā)生率高達(dá)64．9%，其中死亡466例占到腎損傷的67．1%，可以看出腎損傷是影響預(yù)后的重要因素。目前認(rèn)為氧化應(yīng)激、炎性損傷、基因異常、細(xì)胞凋亡、鈣超載等諸多因素參與腎損害的發(fā)生與發(fā)展。

NF－κB作為一種多效轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)表達(dá)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，逐漸證實(shí)它激活后在感染、中毒等疾病致多臟器功能損害中的重要角色。佟飛等［6］建立大鼠急性肺損傷模型后，采用電泳遷移率法檢測(cè)大鼠肺組織NF－κB活性，發(fā)現(xiàn)染毒組NF－κB活性明顯高于對(duì)照組和治療組，提示急性肺損傷時(shí)NF－κB活性增強(qiáng)。TNF－α參與機(jī)體炎癥反應(yīng)和免疫過(guò)程，是介導(dǎo)機(jī)體炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因子，可以通過(guò)NF－κB誘導(dǎo)表達(dá)，也可以通過(guò)自分泌和旁分泌調(diào)節(jié)自身及其它因子的表達(dá)，對(duì)腎臟產(chǎn)生潛在的損害作用。NF－κB主要由P50和P65兩個(gè)亞基組成，通常與抑制蛋白IκB形成三聚體，以失活狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中。氧化應(yīng)激時(shí)，機(jī)體活性氧大量增加引起IκB－NF－κB復(fù)合體降解，NF－κB活化，在基因水平啟動(dòng)包括TNF－α、IL－8等炎癥因子和炎性介質(zhì)的表達(dá)，參與炎癥、組織器官纖維化、細(xì)胞再生和凋亡等病理生理過(guò)程。已有研究提示急性PQ中毒后NF－κB被激活上調(diào)TNF－α的轉(zhuǎn)錄，使TNF－α等炎性因子生成增多，研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)TNF作為細(xì)胞因子家族中最強(qiáng)效的炎癥介質(zhì)，在結(jié)合TNF－R以后，可刺激 NF－κB與IKB解離。此時(shí)，TNF－α－NF－κB 形成了一個(gè)正反饋 信號(hào)，促使TNF－α大量表達(dá)，這種惡性循環(huán)在及 MODS的發(fā)生發(fā)展中有重要意義。

本研究成功建立PQ腹腔注射染毒大鼠動(dòng)物模型，染毒后數(shù)小時(shí)出現(xiàn)不同程度的血尿、少尿或無(wú)尿及神經(jīng)精神癥狀，血肌酐、尿素氮升高，HE染色見(jiàn)腎小球體積增大，近曲小管上皮細(xì)胞腫脹、變性、空泡樣變、壞死，腎小管管腔變窄甚至閉鎖，間質(zhì)充血、水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，提示PQ中毒早期可致腎損傷，尤其在重度中毒組。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)腎組織TNF－α濃度在B組24h、C組12h時(shí)開(kāi)始升高，以后的時(shí)間點(diǎn)呈逐漸增加趨勢(shì)，尤其在NF－κB表達(dá)后顯著升高，在時(shí)間上與腎組織病理?yè)p害程度相關(guān)，故認(rèn)為TNF－α介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)參與急性腎損傷的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程。本研究顯示PQ中毒后12h即出現(xiàn)腎臟組織NF－κB的表達(dá)升高，且持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間，提示NF－κB可能參與了腎臟炎性損害及功能衰竭的發(fā)生。中毒后24h大鼠腎組織TNF－α水平開(kāi)始升高，至72h達(dá)峰值，各時(shí)間點(diǎn)結(jié)果與對(duì)照組比較均有顯著性差異，且腎組織TNF－α明顯升高出現(xiàn)在NF－κB高表達(dá)之后，提示NF－κB被激活后上調(diào)TNF－α的轉(zhuǎn)錄，使TNF－α生成增多。NF－κB活化抑制炎癥細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞數(shù)量異常增加，炎癥細(xì)胞過(guò)度激活后釋出大量細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)，造成組織損傷。而組織損傷、大量的促炎細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)反過(guò)來(lái)又促進(jìn)NF－κB的活化，形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，使機(jī)體出現(xiàn)器官損傷或功能障礙。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)推測(cè)，NF－κB參與的炎癥反應(yīng)，也是PQ中毒者多臟器功能障礙或死亡的－個(gè)重要因素。

已有研究表明，NF－κB在炎性介質(zhì)的激活和SIRS的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，本研究發(fā)現(xiàn)在PQ中毒后腎組織NF－κB高表達(dá)，提示NF－κB可能參與了PQ中毒早期腎臟損害，如果在疾病早期適度地抑制NF－κB的激活，進(jìn)而下調(diào)炎性介質(zhì)的產(chǎn)生，將會(huì)為治療急性PQ中毒早期引起的腎臟損傷和器官衰竭提供－種新的治療辦法。

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