西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院皮膚科 （西安710004） 王 瓊 袁景奕 王秀瑩 董穎穎 張鼎偉

增生性瘢痕（HS）是一種頑固的皮膚病，目前常用的各種治療方法并不理想，還會(huì)產(chǎn)生不同程度的不良反應(yīng)［1，2］。光動(dòng)力療法（PDT）廣泛應(yīng)用于各種腫瘤性疾病和皮膚病，并且不會(huì)產(chǎn)生顯著的不良反應(yīng)［3］?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）和金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMPs）對(duì)細(xì)胞、血管、組織具有復(fù)雜的調(diào)節(jié)作用。因此我們提出PDT的作用機(jī)理與調(diào)節(jié) MMPs／TIMPs的平衡有關(guān)，擬使用不同濃度的5－氨基酮戊酸（ALA）－PDT對(duì)兔耳HS模型進(jìn)行干預(yù)，觀察其對(duì)皮損外觀、組織病理的影響。同時(shí)檢測(cè)標(biāo)本中 MMP－2、3、9及TIMP－1蛋白的表達(dá)和β－半乳糖苷酶（β－gal）濃度，初步探討PDT對(duì)的HS的治療作用機(jī)制。

材料與方法

1 材料與試劑

1．1 主要儀器試劑：XD－635AB型光動(dòng)力激光治療儀和ALA購自中國上海復(fù)旦張江生物醫(yī)藥股份有限公司。RNA抽提試劑盒Rneasy kit購自德國Qiagen公司。熒光定量RT－PCR分析儀、SYBR green與Taq－DNA聚合酶混合試劑LightCycler均購自瑞士Roche公司。β－gal酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒購自美國santa cruz公司。

1．2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選擇新西蘭大耳白兔10只，雌雄不限，質(zhì)量2．0－2．5kg，飼養(yǎng)環(huán)境22±2℃，12h晝夜循環(huán)。參照Kloeters等的方法建立兔耳HS模型［4］。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2．1 實(shí)驗(yàn)分組：將形成的HS隨機(jī)分為5組，造模后第3周進(jìn)行ALA－PDT干預(yù)：①20%ALA組局部使用ALA溶液濃度236mg／ml；②10%ALA組使用溶液濃度118mg／ml；③直接照射組（Dr）不使用ALA溶液；④無任何處理的陰性對(duì)照組（Neg）；⑤選取陰性對(duì)照組兔耳正常皮膚組織作為正常對(duì)照組（Nor）。具體方法：用配好的ALA藥液浸濕醫(yī)用藥棉，覆蓋于創(chuàng)面，封包3h后進(jìn)行激光照射，設(shè)置為光斑1．0cm，時(shí)間20min，能量密度114．6J／cm2。于瘢痕形成后每周處理1次，總共4次。于治療結(jié)束后60d觀察各組瘢痕形態(tài)。

2．2 Masson膠原染色：根據(jù)Masson’s三色染色試劑盒操作說明，組織切片用二甲苯去石蠟，梯度乙醇水化，在Weigert＇s蘇木紫工作液中染色10min，品紅溶液染色5min，置于1% 磷酸鹽溶液中浸5min后將切片移至甲苯胺藍(lán)溶液染色5min，漂洗、脫水、清潔、包埋，膠原纖維被染成藍(lán)色。

2．3 RT－PCR 測(cè) MMP／TIMP mRNA：使 用Rneasy kit試劑盒進(jìn)行組織總RNA的抽提，用Taq－Man逆轉(zhuǎn)錄試劑進(jìn)行RT－PCR，利用熒光定量RTPCR分析儀LightCycler和SYBR green與Taq－DNA聚合酶混合試劑對(duì) MMP－2、3、9、TIMP－1和 GAPDH的mRNA起始量進(jìn)行分析比對(duì)，從溶解曲線可以確定Ct值和樣本中最初的mRNA拷貝數(shù)。結(jié)果數(shù)據(jù)以所檢測(cè)的mRNA拷貝數(shù)／GAPDH mRNA拷貝數(shù)的相對(duì)值表示。

2．4 ELISA法測(cè)β－gal濃度：皮膚組織勻漿離心取上清，按ELISA試劑盒說明書操作，用450nm酶標(biāo)儀檢測(cè)并生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出最終結(jié)果。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13．0統(tǒng)計(jì)軟件包作數(shù)據(jù)處理，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用ANOVA方差分析。

結(jié) 果

1 外觀形態(tài)變化：兔耳創(chuàng)面上皮化后局部形成高出于周圍正常組織的瘢痕，共造80個(gè)創(chuàng)面，術(shù)后3周最終形成78處HS模型，選取其中72處作為實(shí)驗(yàn)觀察對(duì)象。在PDT治療4次后，瘢痕組織開始出現(xiàn)軟化、變平，增生塊顏色逐漸變淡。治療后60d，瘢痕明顯軟化，顏色和質(zhì)地均接近正常皮膚。20%ALA組較10%ALA組為好，10%ALA組較Dr組為好。

2 Masson膠原染色：陰性對(duì)照組兔耳HS（圖1 E）與正常皮膚組織（圖1A）比較可見大量藍(lán)染較深的膠原纖維，增厚密集，外形粗大，排列雜亂無章。治療后60d的HS雖然也可見藍(lán)染的膠原纖維，但較治療前藍(lán)染變淺且纖細(xì)，膠原纖維數(shù)量減少，排列疏散并趨于一致，并且改善程度20%ALA組（圖1B）＞10%ALA組（圖1C）＞Dr組（圖1D）。20%ALA組的組織病理形態(tài)已接近正常對(duì)照。

圖1 各組膠原纖維 Masson染色（光鏡×400）A：正常對(duì)照組，B：20%ALA組，C：10%ALA組，D：Dr組，E：陰性對(duì)照組

圖2 熒光定量RT－PCR檢測(cè) MMP／TIMP mRNA結(jié)果（與陰性對(duì)照組比較，＊P＜0．05，＊＊P＜0．01，＊＊＊P＜0．001）

圖3 ELISA法檢測(cè)β－gal濃度結(jié)果（與陰性對(duì)照組比較＊P＜0．05，＊＊P＜0．01，＊＊＊P＜0．001）

3 RT－PCR測(cè) MMP／TIMP mRNA：RT－PCR結(jié)果顯示 MMP－2、3、9和 TIMP－1在正常皮膚組織中的mRNA表達(dá)量均較少。陰性對(duì)照組MMPs mRNA表達(dá)受抑制，低于正常，經(jīng)PDT治療后升高，20%ALA組＞10%ALA組＞Dr組。陰性對(duì)照組TIMP－1mRNA呈強(qiáng)表達(dá)，經(jīng)治療后降低，20%ALA組＜10%ALA組＜Dr組。GAPDH mRNA在各組的表達(dá)無顯著差異（圖2）。

4 ELISA法測(cè)β－gal濃度：所有PDT治療組的βgal濃度水平顯著高于陰性對(duì)照組，其中20%ALA組＞10%ALA組＞Dr組，并且20%ALA組水平接近于正常對(duì)照組（圖3）。表明PDT可促進(jìn)成纖維細(xì)胞的老化。

討 論

機(jī)體內(nèi)的細(xì)胞衰老是一種重要的抗腫瘤防衛(wèi)機(jī)制，創(chuàng)傷修復(fù)過程中老化型成纖維細(xì)胞在控制其增殖和膠原合成方面起著重要的作用，是瘢痕形成的重要抑制因素［5］。我們以往在培養(yǎng)成纖維細(xì)胞過程中也發(fā)現(xiàn)復(fù)制老化的成纖維細(xì)胞I、Ⅲ型膠原合成量減少［6］。病理性瘢痕現(xiàn)有的手術(shù)切除、放療等治療方法無法誘導(dǎo)病變部位發(fā)生足夠量的細(xì)胞老化，同時(shí)還會(huì)引起細(xì)胞凋亡或壞死，死亡的細(xì)胞又會(huì)誘發(fā)新一輪的增殖修復(fù)，造成了臨床療效差且復(fù)發(fā)率高。因此，如果使成纖維細(xì)胞提前進(jìn)入衰老階段，控制其細(xì)胞增殖及膠原合成，將有可能從根本上改變各種病理性瘢痕的發(fā)展。

研究發(fā)現(xiàn)MMPs／TIMPs在HS組織及光老化皮膚中的表達(dá)明顯異于正常皮膚，MMP1、MMP2、MMP3和MMP9的聯(lián)合作用可以降解大部分真皮ECM［7～9］，而 TIMP1 主 要 抑 制 MMP1、MMP3 和MMP9［10］。我們的研究中，陰性對(duì)照組兔耳 MMPs表達(dá)最低，TIMP1表達(dá)最高，表明在兔耳的HS組織中細(xì)胞老化受到抑制，給予PDT后的各組兔耳MMPs表達(dá)明顯升高、活性增強(qiáng)，同時(shí)TIMP1表達(dá)和活性降低，表示應(yīng)用PDT可誘導(dǎo)瘢痕形成過程中的MMPs／TIMPs比例發(fā)生變化，促進(jìn)成纖維細(xì)胞老化，從而顯著降低膠原蛋白和ECM的合成、抑制HS形成。

本實(shí)驗(yàn)中對(duì)兔耳HS模型形成的早期（術(shù)后第3周）即開始進(jìn)行PDT治療，使用較高濃度ALA治療4次后效果非常滿意，目前很多應(yīng)用PDT治療瘢痕的研究也表明對(duì)此類患者早期治療的療效更佳［11］。另外，由于PDT的無創(chuàng)性，并且對(duì)新愈合的創(chuàng)面也無明顯刺激和毒副作用，因此我們建議對(duì)HS患者在發(fā)病早期進(jìn)行PDT治療，并且適當(dāng)增加光敏劑的濃度以達(dá)到更好的療效。另外PDT治療各種病理性瘢痕還具有以下優(yōu)勢(shì)：①PDT組織選擇性好、作用于光敏藥物局部、毒性低、創(chuàng)傷小，可最大程度的保護(hù)容貌及重要器官功能。②病理性瘢痕形成過程中增殖旺盛的成纖維細(xì)胞功能活躍，這些細(xì)胞較普通細(xì)胞可以攝取并儲(chǔ)蓄更多的光敏劑。本研究為PDT治療病理性瘢痕提供了理論支持和依據(jù)，并對(duì)病理性瘢痕的治療提供新的思路。

［1］ 吳紅娟，劉曉梅，朱秀梅．燒傷后瘢痕畸形病人的社會(huì)支持狀況分析［J］．陜西醫(yī)學(xué)雜志，2009，38（6）：760－761．

［2］ Nicholas RS，F(xiàn)alvey H，Lemonas P，et al．Patient－related keloid scar assessment and outcome measures［J］．Plast Reconstr Surg，2012，129（3）：648－656．

［3］ Lee Y，Baron ED．Photodynamic therapy：current evidence and applications in dermatology［J］．Semin Cutan Med Surg，2011，30（4）：199－209．

［4］ Kloeters O，Tandara A，Mustoe TA．Hypertrophic scar model in the rabbit ear：a reproducible model for studying scar tissue behavior with new observations on silicone gel sheeting for scar reduction［J］．Wound Repair Regen，2007，15Suppl 1：S40－5．

［5］ Blazic TM，Brajac I．Defective induction of senescence during wound healing is a possible mechanism of keloid formation［J］．Med Hypotheses，2006，66（3）：649－652．

［6］ Wang Q，Peng Z，Xiao S，et al．RNAi－mediated inhibition of COL1A1and COL3A1in human skin fibroblasts［J］．Exp Dermatol，2007，16（7）：611－617．

［7］ Ulrich D，Ulrich F，Unglaub F，et al．Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in patients with different types of scars and keloids［J］．J Plast Reconstr Aesthet Surg，2010，63（6）：1015－1021．

［8］ Yeh FL，Shen HD，Tai HY．Decreased production of MCP－1and MMP－2by keloid－derived fibroblasts［J］．Burns，2009，35（3）：348－351．

［9］ Quan T，Qin Z，Xia W，et al．Matrix－degrading metalloproteinases in photoaging［J］．J Investig Dermatol Symp Proc，2009，14（1）：20－24．

［10］ 李 偉，方 婷，于叔麒，等．基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑與腦出血預(yù)后的關(guān)系［J］．陜西醫(yī)學(xué)雜志，2012，41（4）：401－404．

［11］ Li X，Zhou ZP，Hu L，et al．Apoptotic cell death induced by 5－aminolaevulinic acid－mediated photodynamic therapy of hypertrophic scar－derived fibroblasts［J］．J Dermatolog Treat，2012，28．［Epub ahead of print］．