孫海燕，郭偉

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，大慶 163319）

三聚氰胺（Melamine）（化學(xué)式：C3H6N6）俗稱密胺、蛋白精，學(xué)名三氨三嗪，分子量126.12，是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機(jī)化合物，被用作化工原料。它是白色晶體，無味，微溶于水，可溶于甲醇、甲醛、乙酸、乙二醇、甘油、吡啶等。雖然三聚氰胺不可用于食品加工或食品添加物，但近年來，三聚氰胺被非法用于牛奶、嬰兒配方奶粉、優(yōu)酸乳、餅干、奶糖以及寵物食品中[1]，通常使用定氮儀檢測(cè)原料乳及制品中蛋白質(zhì)的含量時(shí)，一些不法者非法添加三聚氰胺而提高蛋白質(zhì)含量。2008年9月，我國有5 000 多嬰幼兒由于食用了被三聚氰胺污染的牛奶和奶粉而導(dǎo)致腎結(jié)石甚至死亡。2011年，市場(chǎng)上又出現(xiàn)了三聚氰胺污染的奶粉。因此，國家為了引導(dǎo)市場(chǎng)奶制品的發(fā)展，監(jiān)測(cè)牛奶以及奶制品中三聚氰胺的含量是非常必要和重要的。由于蛋白質(zhì)而導(dǎo)致懸浮物的存在，因此牛奶是復(fù)雜的樣品基質(zhì)，目前已經(jīng)有許多檢測(cè)方法應(yīng)用于三聚氰胺的定量檢測(cè)，主要包括液相色譜法[2-5]，薄層色譜法[6]，毛細(xì)管電泳[7-9]。對(duì)于嬰幼兒奶粉，目前應(yīng)用廣泛的為液相色譜法，而這種方法不但檢出限高，而且不能很好地判斷三聚氰胺的假陽性結(jié)果，因此檢測(cè)結(jié)果不可靠，并且對(duì)于樣品中三聚氰胺含量低于檢出限而高于規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)的也無法檢出。

采用氣相色譜質(zhì)譜法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）測(cè)定了嬰幼兒牛奶以及奶制品中三聚氰胺的殘留量，取得了滿意的效果。與上述其他方法相比較，該方法具有靈敏度高、檢出限低，因此被廣泛的應(yīng)用到原料乳及乳制品中三聚氰胺的檢測(cè)。

1 材料和方法

1.1 試劑和材料

試劑：甲醇（色譜純，F(xiàn)isher）；吡啶（色譜純，Sigma）；衍生化試劑：99%BSTFA+1%TMCS（色譜純，Sigma）；氨水（分析純，天津科密歐）；乙酸鉛（分析純，天津科密歐）；三氯乙酸，（分析純，天津科密歐）；三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品（＞99.9%，中國計(jì)量科學(xué)研究院）；氨化甲醇（5 mL 氨水+95 mL 甲醇）。

材料：固相萃取小柱（Oasis MCX，60 mg·3 mL-1）；氦氣（99.999%）；50 mL 比色管，50 mL 離心管，所有試驗(yàn)樣品均購于大慶市當(dāng)?shù)爻?，?chǔ)存于4 ℃冰箱。

1.2 儀器設(shè)備

離心機(jī)（ZH 36 K，德國HERMLE）；超聲波清洗機(jī)（SK8200H，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；分析天平（梅特勒，感量0.000 1 g）；固相萃取裝置（ASE-12，天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；氮?dú)獯蹈蓛x（MTN-2800D，天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；旋渦混合器（XW-80A，江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；超純水處理器（CAHT-30L，北京湘順源科技有限公司）；電子恒溫箱（DGG-9240A，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）。

1.3 GC-MS 條件

GCMS-QP2010 plus 氣相色譜-質(zhì)譜儀（日本島津公司）：配有電子轟擊離子源（EI）。GC-MS 條件：色譜柱：Rxi-5ms（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；程序升溫：100 ℃保持1 min，以10 ℃·min-1的速率升溫至220 ℃，保持1 min，以15 ℃·min-1升高至280 ℃，保持4 min；傳輸線溫度：280 ℃；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣量：1 μL。電離方式：電子轟擊電離（EI）；電離能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；掃描模式：選擇離子掃描（SIM），定性離子m/z 99、171、342，定量離子m/z 327。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

準(zhǔn)確稱取100 mg（精確到0.100 g）三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL 容量瓶中，用50%甲醇水溶液溶解并定容至刻度，配制成濃度為1 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；準(zhǔn)確吸取1 mg·mL-1三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1 mL于100 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為10 g·mL-1，于4 ℃冰箱內(nèi)儲(chǔ)存，有效期3 個(gè)月。

1.5 樣品前處理

1.5.1 牛奶及乳制品的提取

稱取5 g 樣品（精確至0.001 g）樣品于50 mL 具塞比色管，加入1%三氯乙酸溶液40 mL，渦漩振蕩30 s，40 ℃下超聲提取15 min，加入2.5%乙酸鉛溶液2 mL，用1%三氯乙酸溶液定容至刻度。充分混勻后，吸取溶液約30 mL 至50 mL 離心試管，以5 000 rpm·min-1離心10 min。上清液待凈化。

1.5.2 凈化

準(zhǔn)確移取5 mL 待凈化液至活化的固相萃取柱中，用3 mL 水、3 mL 甲醇淋洗，抽干后用3 mL 5%氨化甲醇溶液以1 mL·min-1的流速洗脫，收集洗脫液，50 ℃下氮?dú)獯蹈伞?/p>

1.5.3 衍生化

取上述氮?dú)獯蹈珊蟮臍埩粑镔|(zhì)，加入600 μL 的吡啶和200 μL 衍生化試劑（99%BSTFA+1%TMCS），混勻，在70 ℃下衍生反應(yīng)30 min 后，GC-MS 法定量檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

分別吸取1 mL 濃度為0、0.04、0.08、0.16、0.4、0.8、1.6 μg·mL-1的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.5.3 條件進(jìn)行衍生化，然后用GC-MS 測(cè)定，線性方程為y=2×106x-98 065，x 表示三聚氰胺溶液濃度（g·mL-1），y代表色譜峰面積，標(biāo)準(zhǔn)曲線圖見圖1。在信噪比（S/N=3）為3 時(shí)，三聚氰胺的最低檢出限為0.02 μg·mg-1，國標(biāo)中液相色譜的最低檢出限為2 μg·mg-1。

圖1 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線圖Fig.1 Standard curve of melamine

2.2 實(shí)際樣品的測(cè)定

試驗(yàn)分別選擇了市售的牛奶、奶粉及酸奶來驗(yàn)證方法的可行性，采用1.5 進(jìn)行樣品前處理，考察了添加濃度水平分別在0.2、0.5、1 μg·mL-1的三聚氰胺在牛奶、奶粉及酸奶中的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差，結(jié)果見表1，空白樣品及加標(biāo)樣品的色譜圖見圖2、圖3、圖4、圖5。

表1 樣品中三聚氰胺的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差Table 1 Recovery and RSD of mMelamine in sample

圖2 空白樣品色譜圖Fig.2 Blank sample chromatogram

圖3 添加0.2 μg·mL-1 三聚氰胺的牛奶色譜圖Fig.3 Milk chromatogram of 0.2 μg·mL-1 melamine

圖4 添加0.5 μg·mL-1 三聚氰胺的奶粉色譜圖Fig.4 Milk powder chromatogram of 0.5 μg·mL-1 melamine

圖5 添加1 μg·mL-1 三聚氰胺的酸奶色譜圖Fig.5 Yoghurt chromatogram of 1 μg·mL-1 melamine

3 結(jié)論

研究了衍生化-氣相色譜質(zhì)譜法檢測(cè)牛奶以及奶制品中三聚氰胺殘留量，三聚氰胺濃度范圍在0.04～1.6 μg·mL-1之間，具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r=0.999 1。利用衍生化的方法分別測(cè)定了牛奶以及奶制品中9 個(gè)樣品的三聚氰胺含量，并測(cè)定了樣品中添加濃度為0.2、0.5、1 μg·mL-1的回收試驗(yàn)，回收率在93.8%～106.4%，連續(xù)進(jìn)樣5 次，RSD 在3.8%～4.9%之間。結(jié)果表明：具有靈敏度高、檢出限低、回收率高的特點(diǎn)，適合含量較低的嬰幼兒牛奶及奶制品中三聚氰胺的定性及定量檢測(cè)。

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