袁 莉 趙 輝 李 琳 王衛(wèi)華

(菏澤醫(yī)學(xué)專科學(xué)校藥理學(xué)教研室，山東菏澤 274000)

肺癌在多數(shù)發(fā)達(dá)國(guó)家居惡性腫瘤首位，在我國(guó)多數(shù)大城市肺癌的發(fā)病率和死亡率也居惡性腫瘤的第一位或第二位，其中，80%為非小細(xì)胞肺癌(nonsmall cell lung carcinoma，NSCLC)。NSCLC的發(fā)生是由于正常細(xì)胞在基因水平失去了對(duì)其生長(zhǎng)的有序調(diào)控，導(dǎo)致異常增生，是由多個(gè)原癌基因和抑癌基因共同參與的多基因、多步驟過(guò)程。有學(xué)者［1］提示PI3K/AKT通路參與NSCLC的發(fā)生和演進(jìn)，在該通路上有很多因子發(fā)揮著不可替代的作用，如活化的AKT(P-AKT)，AKT于細(xì)胞內(nèi)的激活(P-AKT)在NSCLC的一系列信號(hào)傳導(dǎo)中起重要作用。本研究通過(guò)檢測(cè)P-AKT在非小細(xì)胞肺癌和正常肺組織中的表達(dá)情況，分析P-AKT的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系，探討P-AKT在NSCLC發(fā)生、發(fā)展中的作用及意義，為非小細(xì)胞肺癌的治療及預(yù)后評(píng)估提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 標(biāo)本

標(biāo)本來(lái)自內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院2005年1月至2006年12月的非小細(xì)胞肺癌的存檔石蠟標(biāo)本66例，所有標(biāo)本均有完整的臨床資料，術(shù)前均未做放療和化療。其中，男性50例，女性16例，年齡范圍28～77歲，中位年齡53歲，＞53歲49例，≤53歲17例。參照WHO肺腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類，按組織學(xué)類型分為腺癌24例，鱗癌42例;按分化程度分類，高中分化44例，低分化22例;≤2 cm 29例，＞2 cm 37例;根據(jù)有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分為有轉(zhuǎn)移組35例和無(wú)轉(zhuǎn)移組31例;根據(jù)有無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移分為有轉(zhuǎn)移組25例和無(wú)轉(zhuǎn)移組41例。對(duì)照組為同期手術(shù)切除的炎性假瘤、支氣管擴(kuò)張病例并遠(yuǎn)離病灶2cm的正常肺組織共10例。

1．2 試劑

兔抗人P-AKT多克隆抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，工作濃度為1∶100);免疫組化Maxvision試劑盒、EDTA(乙二胺四乙酸)抗原修復(fù)液及DAB顯色劑均來(lái)自福建邁新生物技術(shù)有限公司。

1．3 方法

采用免疫組織化學(xué)Maxvision二步法進(jìn)行操作，步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。已知陽(yáng)性切片定為陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗定為空白對(duì)照。

1．4 結(jié)果判斷

P-AKT的陽(yáng)性染色部位位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。參考相關(guān)文獻(xiàn)并作適當(dāng)修改判斷本研究的染色結(jié)果為［2］:隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(×400)，每個(gè)視野記數(shù)100個(gè)癌細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性癌細(xì)胞數(shù)占總癌細(xì)胞數(shù)的百分比，陽(yáng)細(xì)胞大于等于25%為陽(yáng)性，小于25%為陰性。

1．5 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS13．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，通過(guò)χ2檢驗(yàn)比較NSCLC與正常肺組織中P-AKT的表達(dá)情況，按照臨床病理特征對(duì)NSCLC組織進(jìn)行分組并分析比較。

2 結(jié)果

2．1 P-AKT在NSCLC與正常肺組織中的表達(dá)情況

P-AKT在非小細(xì)胞肺癌和正常肺組織中的陽(yáng)性率分別為 75．8%(50/66)、20．0%(2/10)。P-AKT在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)顯著高于正常肺組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05，圖1～4)。

圖1 P-AKT在正常支氣管粘膜上皮中的表達(dá)染色部位以胞漿為主，部分核及核膜也著色(400×)

圖2 P-AKT在高分化肺腺癌中的表達(dá)染色部位以胞漿為主，部分核及核膜也著色(400×)

圖3 P-AKT在低分化肺腺癌中的表達(dá)染色部位以胞漿為主，部分核及核膜也著色(400×)

圖4 P-AKT在高分化肺鱗癌中的表達(dá)染色部位以胞漿為主，部分核及核膜也著色(400×)

2．2 NSCLC中P-AKT與臨床病理特征的關(guān)系

P-AKT在非小細(xì)胞肺癌中的陽(yáng)性率為75．8%(50/66)，與癌組織的淋巴轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及分化程度密切相關(guān)(P＜0．05)。在有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的非小細(xì)胞肺癌病例中，有轉(zhuǎn)移的陽(yáng)性率為88．6%(31/35)，明顯高于無(wú)轉(zhuǎn)移的陽(yáng)性率61．3%(19/31)，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05);在有無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組的非小細(xì)胞肺癌病例中，M1的陽(yáng)性率為96．0%(24/25)，明顯高于 M0的陽(yáng)性率63．4%(26/41)，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05);在不同分化程度的非小細(xì)胞肺癌病例中，高中分化組的陽(yáng)性表達(dá)率為68．2%(30/44)，顯著低于低分化組的陽(yáng)性表達(dá)率90．9%(20/22)，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。見(jiàn)表1。

表1 P-AKT與臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

AKT是Staal SP等在研究逆轉(zhuǎn)錄病毒Akt8時(shí)發(fā)現(xiàn)在該逆轉(zhuǎn)錄病毒中含有一種細(xì)胞誘導(dǎo)的癌基因序列。AKT是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，為原癌基因，因其與致小鼠白血病病毒v-Akt高度同源而得名。AKT蛋白結(jié)構(gòu)中N末端含PH功能域，該域大約由100個(gè)氨基酸組成，并與其它可結(jié)合PIP3的PH功能域存在高度相似性［3-4］。中部為催化活性區(qū)，C末端含調(diào)節(jié)活性區(qū)。AKT在PI3K(phosphoinositide 3-OH kinase，PI3K)和 PDK(3-phosphninosotidde-dependent protein kinase)的作用下發(fā)生磷酸化，其磷酸化位置位于調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域Ser473位點(diǎn)和催化結(jié)構(gòu)域Thr308位點(diǎn)，AKT充分活化依賴于兩個(gè)位點(diǎn)全部磷酸化［5］。PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)通路發(fā)揮作用的關(guān)鍵在于AKT的完全活化(P-AKT)?；罨蟮腁KT(p-AKT)主要在胞漿進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)，這與本研究結(jié)果一致，P-AKT可磷酸化多種下游蛋白分子，如 BAD、FKHR、NF-KB、MDM2、GSK3β、mTOR等，通過(guò)對(duì)其下游的靶蛋白進(jìn)行磷酸化而發(fā)揮其抗凋亡作用，參與NSCLC等多種惡性腫瘤的發(fā)生。

據(jù)研究表明，在乳腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、胰腺癌、前列腺癌、多發(fā)性骨髓瘤及甲狀腺癌等癌組織中均有P-AKT的高表達(dá)。Kim等［6］通過(guò)構(gòu)建甲狀腺激素受體β基因表達(dá)突變的的鼠模型，來(lái)誘發(fā)甲狀腺癌并使其發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，經(jīng)免疫組化和共聚焦顯微鏡發(fā)現(xiàn)，在原發(fā)病灶和轉(zhuǎn)移病灶中活化的AKT都有過(guò)表達(dá)，表明P-AKT參與甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展，并與癌組織的轉(zhuǎn)移有關(guān)。She QB等［7］研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中PI3K的突變有選擇性的依賴AKT發(fā)信號(hào)，由此證明在活體內(nèi)直接抑制AKT可作為治療乳腺癌和其他腫瘤的靶點(diǎn)，同時(shí)也表明AKT在該通路中扮演著重要角色，若可抑制AKT的活化，則可能對(duì)腫瘤的治療有一定幫助，甚至阻止腫瘤的繼續(xù)發(fā)展，這與Kallergi G的研究結(jié)果相似。在Kallergi G等［8］研究中:PI3K和p-AKT在乳腺癌早期和轉(zhuǎn)移病變的循環(huán)腫瘤細(xì)胞中表達(dá)分別為88%和81%，總結(jié)得出，PI3K/AKT通路可以作為消除乳腺癌中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的靶點(diǎn)。Hua K等［9］研究提出PI3K/AKT還參與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移。在本研究結(jié)果中，P-AKT在非小細(xì)胞肺癌和正常肺組織的陽(yáng)性率分別為 75．8%(50/66)、20．0%(2/10)，與癌組織的淋巴轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和分化程度有關(guān)(P＜0.05)，與湯建民等［10］的研究結(jié)果一致，湯建民等利用免疫組化SP法檢測(cè)P-AKT在NSCLC和正常肺組織的表達(dá)情況，結(jié)果表明P-AKT在NSCLC中明顯高表達(dá)，并與有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及分化程度和臨床分期有關(guān)，進(jìn)一步說(shuō)明，原癌基因AKT參與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)展。

近年學(xué)者們研究認(rèn)為P-AKT可促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，抑制細(xì)胞的凋亡，由此促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的形成、惡性轉(zhuǎn)化及侵襲轉(zhuǎn)移。以上均提示，P-AKT可參與包括NSCLC在內(nèi)的多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，檢測(cè)P-AKT的表達(dá)情況有助于判斷非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生及發(fā)展程度，對(duì)其治療有一定的指導(dǎo)意義。

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