馬敏先 周祥文 王 永 王 梅 (貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔修復(fù)科，貴州 貴陽(yáng) 563003)

口腔種植技術(shù)與傳統(tǒng)的修復(fù)方法相比，由于具有更接近于天然牙的功能和美學(xué)修復(fù)效果，目前已成為修復(fù)牙列缺損或缺失的主要方法之一。然而，許多患者由于缺牙后的生理性吸收、外傷性缺損等因素造成牙槽骨骨量不足，而無(wú)法進(jìn)行口腔種植修復(fù)。目前采用的骨組織引導(dǎo)再生術(shù)只能修復(fù)較小的骨缺損;自體骨移植雖然安全可靠，無(wú)免疫排斥，但存在供骨區(qū)并發(fā)癥的可能;異體骨移植能修復(fù)較大骨缺損，但存在免疫排斥。組織工程可以通過(guò)提取自體細(xì)胞體外培養(yǎng)骨組織來(lái)修復(fù)大段骨缺損，因此已成為口腔種植領(lǐng)域的主要研究方向〔1〕。組織工程的兩個(gè)重要因素分別是種子細(xì)胞和支架材料。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)由于具有高度自我更新能力及多向分化潛能，而成為最常用的種子細(xì)胞之一。支架材料目前以聚乳酸、聚羥基乙酸及其共聚物等為代表的高分子可吸收材料應(yīng)用最為廣泛。3-羥基丁酸/3-羥基己酸共聚物(PHBHHx)因其出色的力學(xué)性能、良好的生物相容性和可完全降解性，而在組織工程和醫(yī)用材料領(lǐng)域備受關(guān)注〔2〕。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)SD大鼠BMSCs誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞與PHBHHx支架材料體外復(fù)合培養(yǎng)，采用MTT法檢測(cè)其體外相容性，從而評(píng)估PHBHHx作為骨組織工程支架材料的可行性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 1～2月齡SD大鼠(貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心)。L-DMEM(美國(guó)Gibco公司)，胎牛血清(杭州四季清公司)，地塞米松、β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸(美國(guó)Sigma公司)。倒置相差顯微鏡(Nikon)，掃描電鏡(貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院電鏡室)。多孔仿生骨支架材料PHBHHx(清華大學(xué)化工系研制)。該材料為三維多孔立體結(jié)構(gòu)，孔徑200～300 μm，孔隙率90%，且孔間相互連通(圖1)。將材料切割成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的正方體塊，高溫高壓消毒備用。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs分離培養(yǎng)及鑒定 采用全骨髓貼壁法分離BMSCs，接種至25 cm2培養(yǎng)瓶中，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。2 d換液一次，待細(xì)胞融合至90% ～95%時(shí)，1∶2傳代。取第三代BMSCs細(xì)胞懸液，平均分成3組:CD29組、CD34組、CD90組，孵育、洗滌后待上流式細(xì)胞儀。

圖1 PHBHHx支架材料(SEM，×1 000)

1.2.2 誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞分化 收集第三代BMSCs分為兩組，對(duì)照組用完全培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組用誘導(dǎo)培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基中加入地塞米松10～8 mol/L、β-甘油磷酸鈉10 mmol/L、維生素C 50 mg/L)。倒置相差顯微鏡下觀察兩者形態(tài)。

1.2.3 成骨細(xì)胞鑒定 將第三代BMSCs以1×104個(gè)/ml細(xì)胞密度接種于6孔培養(yǎng)板中(內(nèi)含處理好的蓋玻片)，同時(shí)加入含誘導(dǎo)劑的完全培養(yǎng)基，維持培養(yǎng)14 d后進(jìn)行堿性磷酸酶和茜素紅染色。堿性磷酸酶染色 固定液固定3 min，滴加底物應(yīng)用液，加蓋疏水膜，放置濕盒中，避光，37℃孵育15 min，水洗，用復(fù)染液染3 min，水洗，拍片記錄。茜素紅染色 無(wú)水乙醇固定10 min，蒸餾水沖洗2次，放入0.1%茜素紅-Tris-HCl(pH8.3)染色，37℃染色30 min，蒸餾水沖洗，拍片記錄。

1.2.4 成骨細(xì)胞與PHBHHx復(fù)合培養(yǎng) 制備好的PHBHHx用含誘導(dǎo)劑的完全培養(yǎng)基浸泡，48 h后吸凈培養(yǎng)基，將第三代BMSCs以1×105個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于材料上，同時(shí)加入含誘導(dǎo)劑的完全培養(yǎng)基，并置于培養(yǎng)箱。24 h后，將細(xì)胞材料復(fù)合物轉(zhuǎn)移至24孔培養(yǎng)板中，并補(bǔ)加培養(yǎng)基至1 ml。2 d換液1次。

1.2.5 掃描電鏡觀察 取培養(yǎng)第9天的細(xì)胞/材料復(fù)合物用PBS清洗，戊二醛固定，梯度乙醇脫水，干燥，噴金，置于掃描電鏡下觀察。

1.2.6 MTT法檢測(cè)成骨細(xì)胞在PHBHHx上的增殖活性 實(shí)驗(yàn)組將第三代BMSCs以1×105個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于PHBHHx，對(duì)照組將BMSCs以同樣密度直接接種于孔板底部，兩者同時(shí)加入200 μl含誘導(dǎo)劑的完全培養(yǎng)基。1、3、5、7、9 d 后，向兩組加入360 μl不含血清的培養(yǎng)基和40 μl MTT(5 g/L)，孵育4 h。棄上清，每孔加入150 μl DMSO，搖勻10 min，然后吸取100 μl加入96孔培養(yǎng)板中，選擇490 nm波長(zhǎng)，酶標(biāo)儀測(cè)定OD值。每組4個(gè)復(fù)孔，以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采 用SPSS11.5軟件分析，數(shù)據(jù)以表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs形態(tài)學(xué)觀察 原代的BMSCs為少量短梭形、星形細(xì)胞分散貼壁生長(zhǎng)，核呈橢圓形，傳代后的細(xì)胞為長(zhǎng)梭形，分布均勻，排列規(guī)則呈流水狀(圖2)。

2.2 BMSCs的表型鑒定 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示CD29、CD90、CD34陽(yáng)性細(xì)胞比率分別為99.1%，88.8%，0.1%，說(shuō)明所獲得的第三代BMSCs純度較高。

2.3 BMSCs誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞的形態(tài)變化及鑒定 誘導(dǎo)組細(xì)胞為三角形、立方形、多邊形，體積增大，胞核內(nèi)出現(xiàn)顆粒狀物質(zhì)，增殖細(xì)胞間界限模糊，繼而復(fù)層生長(zhǎng)。對(duì)照組細(xì)胞仍為長(zhǎng)梭形(圖3)。堿性磷酸酶染色結(jié)果顯示，細(xì)胞核呈紫色，胞質(zhì)中出現(xiàn)褐色或咖啡色顆粒。茜素紅鈣化結(jié)節(jié)染色細(xì)胞匯合后呈多層重疊生長(zhǎng)，圓形的礦化結(jié)節(jié)呈紅色(圖4)。

2.4 成骨細(xì)胞在PHBHHx上的黏附情況 在300倍鏡下可見(jiàn)材料上的成骨細(xì)胞融合成片狀，邊緣有許多不規(guī)則的突起;而在1 000倍鏡下，成骨細(xì)胞伸出多個(gè)偽足固定于孔隙之間，部分細(xì)胞間以突起相互連接，沿孔道呈堆積樣生長(zhǎng)，排列密集，分布均勻(圖5)。

2.5 MTT法檢測(cè)成骨細(xì)胞增殖情況 從接種后的第1天開(kāi)始，細(xì)胞已較好地附著在培養(yǎng)板上。培養(yǎng)前3 d，細(xì)胞增殖緩慢，3 d后，細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，增殖加速，持續(xù)到第7天。7 d后，細(xì)胞進(jìn)入平臺(tái)期，部分細(xì)胞開(kāi)始凋亡，增殖放緩并略有下降。細(xì)胞接種后第3天開(kāi)始，兩組相比差異顯著(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

圖2 原代、第三代BMSCs在倒置相差顯微鏡圖像

圖3 誘導(dǎo)組與對(duì)照組細(xì)胞倒置相差顯微鏡圖像(×100)

圖4 成骨細(xì)胞染色結(jié)果

圖5 成骨細(xì)胞和PHBHHx支架材料復(fù)合培養(yǎng)后掃描電鏡

表1 PHBHHx對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響(OD，，n=12)

表1 PHBHHx對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響(OD，，n=12)

與對(duì)照組比較:1)P＜0.05

組別 第1天 第3天 第5天 第7天 第9天PHBHHx組 0.182±0.001 0.253±0.0031) 0.354±0.0051) 0.589±0.0011) 0.576±0.0011)0.002 0.505±0.001對(duì)照組 0.182±0.002 0.242±0.002 0.310±0.011 0.524±

3 討論

組織工程是通過(guò)一定的技術(shù)手段將種子細(xì)胞和支架材料有機(jī)結(jié)合起來(lái)，在支架材料逐步降解的同時(shí)，附著在材料上的細(xì)胞不斷增殖，最終形成骨組織。因此種子細(xì)胞、支架材料已成為組織工程的研究熱點(diǎn)。

BMSCs相對(duì)特異的表面抗原分別為 CD29、CD90、CD106等，非特異抗原為 CD34、CD45 等〔3，4〕。本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明此細(xì)胞中造血干細(xì)胞含量極少，純度較高，同時(shí)對(duì)其進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，通過(guò)堿性磷酸酶和茜素紅染色呈陽(yáng)性結(jié)果，可以說(shuō)明所培養(yǎng)的細(xì)胞為BMSCs。

本實(shí)驗(yàn)選用的PHBHHx是以HB(3-羥基丁酸酯)單體為主要成分，含有少量HHx(3-羥基己酸酯)單體的第三代PHAs(聚羥基脂肪酸酯)，是硬度和韌度都有良好的熱塑性材料〔5〕。同時(shí)，由于其最終分解為CO2和水，pH呈弱酸性，所以體內(nèi)植入后炎癥反應(yīng)發(fā)生率極低〔6〕，是近年來(lái)頗受關(guān)注的生物可降解材料。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞在PHBHHx支架材料上能較好地黏附和增殖?？紤]其原因可能為:微米級(jí)的孔徑可以為細(xì)胞的機(jī)械性刺激感受器提供合適的壓力和張力，有利于細(xì)胞增殖和黏附〔7，8〕;三維多孔支架材料的立體結(jié)構(gòu)更有利于細(xì)胞吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和排出代謝產(chǎn)物，同時(shí)也為細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖提供寬敞空間。7 d后成骨細(xì)胞增殖放緩并略有下降，其原因可能是:培養(yǎng)板中材料大小有限，不能為不斷增殖的細(xì)胞提供更多的生長(zhǎng)空間，代謝廢物積聚較多，使部分細(xì)胞開(kāi)始衰老、凋亡。PHBHHx是一種既疏水又不帶電荷的材料，實(shí)驗(yàn)通過(guò)用含誘導(dǎo)劑的完全培養(yǎng)基浸泡支架材料的方法，提高材料的親水性，結(jié)果發(fā)現(xiàn):材料上的成骨細(xì)胞表面光滑、增殖較快，說(shuō)明經(jīng)含誘導(dǎo)劑的完全培養(yǎng)基浸泡后的材料能模擬細(xì)胞的體外生長(zhǎng)環(huán)境，有利于細(xì)胞的黏附和增殖。

我們將進(jìn)一步對(duì)PHBHHx何時(shí)植入裸鼠體內(nèi)及移植到負(fù)重部位后對(duì)其性狀和細(xì)胞的影響等方面進(jìn)行研究。PHBHHx與成骨細(xì)胞有良好的體外相容性，是一種性能優(yōu)良的骨組織工程支架材料，但其應(yīng)用于骨組織工程的有效性，還有待于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步探討。

1 Jayasuriya AC，Shah C，Ebraheim NA，et al.Acceleration of biomimetic mineralization to apply in bone regeneration〔J〕.Biomed Mater，2008;3(1):015003(6PP).

2 Chen GQ，Wu Q，Wang YW，et al.Application of microbial polyesterspolyhydroxyalkanoates as tissue engineering materials.Asbmb:Advanced Biomaterials Vi〔M〕.Zrich-Uetikon:Trans Tech Publications Ltd，2005:437-40.

3 Jing Xi，Liang Zhang.Preparation and evaluation of porous poly(3-hydroxybutyrate-co-hydroxycaproate)hydroxyapatite composite scaffolds〔J〕.J Biomater Appl，2008;22(4):293-30.

4 McLucas E，Rochev Y，Carroll WM，et al.Analysis of the effects of surface treatments on nickel release from nitinol wires and their impact on candidate gene expression in endothelial cells〔J〕.J Mater Sci Mater Med，2008;19(3):975-80.

5 Chen GQ，Wu Q，Zhao K，et al.Functional polyhydroxyalkanoates Synthesized by Microorganisms〔J〕.Chinese J Polymer Sci，2000;18(5):389.

6 Masaya Hiramitsu，Yoshiharu Doi，Ken Webb.Microbial synthesis and characterization of poly(3-hydro-xybutyrate-co-3-hydroxypropionate)〔J〕.Polymer，1993;34(22):4782-6.

7 Liao SS，Cui FZ.In vitro and in vivo degradation of the mineralized collagen-based composite scaffold:nanohydroxyapatite/collagen/polyZ(L-lactide)〔J〕.Tissue Engineering，2004;10(1):72-80.

8 葉 川，尹培榮，吳承龍.明膠海綿與人胚半月板細(xì)胞構(gòu)建復(fù)合物的研究〔J〕.貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005;30(1):15-7.