蘆北極 王貴清 劉春磊 (暨南大學(xué)附屬清遠(yuǎn)醫(yī)院骨科，廣東 清遠(yuǎn) 511500)

髖關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎是一種高致殘疾病，主要特征是關(guān)節(jié)功能減退并伴有疼痛〔1〕。骨關(guān)節(jié)炎的主要病理表現(xiàn)為軟骨組織退變和磨損，軟骨損傷后很難修復(fù)〔2〕，因此加快軟骨組織修復(fù)對(duì)治療髖關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎意義重大。Ⅱ型膠原是關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)膠原，由3條相同的Ⅱ型膠原α1鏈(Col2α1)組成，是軟骨組織修復(fù)的基礎(chǔ)〔3〕。關(guān)節(jié)炎是一種炎癥因子介導(dǎo)的免疫反應(yīng)〔4〕。激活T細(xì)胞核因子1(NFAT1)是一種與炎癥相關(guān)的基因，可在T細(xì)胞及其他免疫細(xì)胞中表達(dá)〔5〕，因此推測(cè)其水平與關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。目前，對(duì)髖關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎軟骨組織中Col2α1和NFAT1的研究較少。因此本研究分析髖關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的Col2α1和NFAT1表達(dá)水平及臨床意義，為防治髖關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料 本院2011年6月至2012年6月骨科收治的36例髖關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎患者為關(guān)節(jié)炎組，其中男性21例，女性15例;年齡43～77歲，平均(65.1±7.5)歲，＞60歲者11例;左側(cè)17例，右側(cè)19例;原發(fā)性4例，繼發(fā)性32例;病程為(2.3±0.9)年，＞2年者 14例;關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重性指數(shù)評(píng)分(ISOA)≤4者16例，＞4者20例;K-L放射線分級(jí):Ⅰ+Ⅱ級(jí)者14例;Ⅲ+Ⅳ級(jí)者22例;輕度10例，中度15例，中度11例。并選取同期的40例股骨頸骨折患者為骨折組，其中男性23例，女性17例;年齡41～75歲，平均(64.8±10.2)歲，＞60歲者16例;左側(cè)25例，右側(cè)15例;骨折部位:頭下型31例，頸中型7例，合并股骨頭骨折2例。排除類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、腫瘤骨轉(zhuǎn)移及股骨頭壞死者。

1.2 組織標(biāo)本收集 軟骨組織標(biāo)本用于mRNA抽提和蛋白提取兩部分，均在本院的倫理委員會(huì)監(jiān)督下進(jìn)行組織標(biāo)本收集，具體步驟:取全髖關(guān)節(jié)置換后的手術(shù)廢棄物，用刀片輕輕刮除髖關(guān)節(jié)表層軟骨，取髖關(guān)節(jié)股骨頭負(fù)重區(qū)域的深層軟骨。

1.3 試劑 RNAlater保存液，美國(guó) Sigma公司;Rneasy Fibrous Tissue Mini kit，德國(guó)Qiagen公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒，大連寶生物工程有限公司;Col2α1、NFAT1鼠抗人單克隆抗體，美國(guó)Santa Cruz公司;GADPH、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記鼠二抗、兔二抗單克隆抗體，武漢博士德生物技術(shù)公司;其他試劑均為分析純。Col2A1和NFAT1引物均由Invitrogen公司合成。

1.4 RT-PCR法檢測(cè)mRNA水平 稱取軟骨標(biāo)本1.2 g，提取總RNA，采用分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度與純度。配制 RT反應(yīng)液(反應(yīng)在冰上進(jìn)行)，在如下條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃ 4 h，將cDNA貯存于－20℃冰箱中備用。對(duì)cDNA模板進(jìn)行優(yōu)化，配置PCR反應(yīng)液，兩步法PCR擴(kuò)增目的基因。預(yù)變性:95℃ 30 s;PCR反應(yīng):95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。結(jié)束后確認(rèn)擴(kuò)增和溶解曲線，以GAPDH為內(nèi)參，采用ΔΔCt法分析實(shí)時(shí)定量擴(kuò)增的效果。Col2α1上游:5'-GGTGTCAGGGCCAGGATGT-3';下游:5'-ACAATATCCTTGATGTCTCCAGGTT-3'。NFAT1上游:5'-AGCAGGGCGAGAGGAGAAAC-3';下游:5'-AGTCACTGGGATGCTGCAGAT-3'。GAPDH上游:5'-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3';下游:5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3'。

1.5 Western印跡法檢蛋白水平 以1∶10(重量/體積)加蛋白裂解液，冰上勻漿處理，靜置1 h，高速離心(12 000 r/min×5 min)，取適量上清液與等體積2×上樣緩沖液混合后，65℃孵育10 min后，經(jīng)過SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)至 PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h后，以一抗為1∶500的抗 Col2α1，NFAT1一抗抗體進(jìn)行雜交，室溫，1 h，以TBST充分洗膜3×5 min后，加入二抗(1∶5 000)進(jìn)行雜交，室溫1 h，以 TBST充分洗膜3×5 min后，采用 ECL法曝光，內(nèi)參為 GAPDH，并運(yùn)用 Quantity-One軟件進(jìn)行光密度分析。最終結(jié)果表示為與GAPDH條帶光密度的比值。

2 結(jié)果

2.1 兩組 Col2α1和 NFAT1的表達(dá)水平比較 關(guān)節(jié)炎組Col2α1和 NFAT1的 mRNA和蛋白水平均高于骨折組，除NFAT1的mRNA水平(P＜0.05)，其余均為P＜0.01，見表1和圖 1、圖 2。

表1 兩組Col2α1和NFAT1的表達(dá)水平()

表1 兩組Col2α1和NFAT1的表達(dá)水平()

與骨折組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01

組別 n mRNA水平(2－△△Ct)Col2α1 NFAT1蛋白水平Col2α1 NFAT1骨折組40 1.06±0.23 1.57±0.15 0.32±0.05 0.28±0.09關(guān)節(jié)炎組 36 1.65±0.412) 2.46±0.341) 0.67±0.112) 0.53±0.142)

圖1 兩組關(guān)節(jié)軟骨中NFAT1和Col2α1表達(dá)水平

圖2 兩組關(guān)節(jié)軟骨中NFAT1和Col2α1蛋白水平的Western原始記錄圖

2.2 髖關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎不同病理參數(shù)的mRNA水平情況Col2α1和NFAT1的mRNA水平在年齡、類型、病程、ISOA、K-L放射線分級(jí)及嚴(yán)重程度上有差異，除Col2α1的K-L放射線分級(jí)(P＜0.05)，其余均為P＜0.01;兩指標(biāo)mRNA水平在性別和側(cè)別上無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見表2。

2.3 髖關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎不同病理參數(shù)的蛋白水平情況Col2α1和NFAT1的蛋白水平在年齡、類型、病程、ISOA、K-L放射線分級(jí)及嚴(yán)重程度上有差異，除Col2α1的類型(P＜0.05)，其余均為P＜0.01;兩指標(biāo)mRNA水平在性別和側(cè)別上無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見表2。

表2 髖關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎患者不同病理參數(shù)Col2α1和NFAT1的mRNA和蛋白水平()

表2 髖關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎患者不同病理參數(shù)Col2α1和NFAT1的mRNA和蛋白水平()

與對(duì)應(yīng)項(xiàng)比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01

年齡(歲)≤60 1.27±0.32 1.86±0.24 0.34±0.12 0.31±0.09＞60 1.82±0.572)2.74±0.612)0.86±0.372)0.78±0.252)側(cè)別左側(cè) 1.57±0.43 2.36±0.31 0.59±0.14 0.47±0.11右側(cè) 1.68±0.46 2.52±0.39 0.72±0.17 0.58±0.15類型原發(fā)性 1.14±0.25 1.93±0.33 0.46±0.26 0.28±0.07繼發(fā)性 1.91±0.612)2.66±0.542)0.83±0.141)0.82±0.222)病程(年)≤2 1.33±0.35 2.07±0.42 0.44±0.15 0.31±0.12＞2 1.87±0.732)2.73±0.632)0.91±0.322)0.77±0.242)性別男 1.58±0.46 2.53±0.47 0.61±0.15 0.58±0.15女 1.69±0.52 2.38±0.35 0.74±0.09 0.51±0.17 ISOA≤4 1.36±0.36 2.13±0.36 0.35±0.12 0.33±0.10＞4 1.88±0.752)2.80±0.722)0.78±0.252)0.81±0.282)K-L放射線分級(jí)Ⅰ+Ⅱ 1.45±0.26 1.93±0.26 0.27±0.08 0.36±0.12Ⅲ+Ⅳ 1.73±0.431)2.85±0.882)0.93±0.262)0.85±0.252)嚴(yán)重程度輕度 1.15±0.28 2.24±0.34 0.34±0.12 0.29±0.14中度+重度 1.82±0.682)2.86±0.552)0.85±0.252)0.83±0.232)

3 討論

Col2α1與關(guān)節(jié)軟骨形成及關(guān)節(jié)內(nèi)成骨密切相關(guān)。異常機(jī)械應(yīng)力和滑膜炎癥可影響軟骨基質(zhì)的代謝平衡，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨表面的Ⅱ型膠原水平降低，同時(shí)機(jī)體會(huì)代償性的增加深面Ⅱ型膠原水平〔6〕。本研究提示關(guān)節(jié)炎患者軟骨組織中的Col2α1水平上調(diào)，可能原因是關(guān)節(jié)炎患者的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致軟骨組織代償性地增加Col2α1水平，來促進(jìn)軟骨組織的修復(fù)。這與Pickarski等〔7〕在前交叉韌帶切斷和半月板切除誘導(dǎo)的骨性關(guān)節(jié)炎模型中的發(fā)現(xiàn)一致，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)損傷部位關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨中的血管浸潤(rùn)標(biāo)記物VEGF和CD31水平的上調(diào)。此外，也有相關(guān)報(bào)道指出Col2α1可改變軟骨細(xì)胞表型，進(jìn)而導(dǎo)致軟骨礦物質(zhì)成分改變和鈣化增厚，使關(guān)節(jié)炎癥狀惡化〔8〕。張雪蓮等〔9〕認(rèn)為Col2α1的異常表達(dá)引起Ⅱ型膠原結(jié)構(gòu)異常，可導(dǎo)致骨骼-軟骨發(fā)育異常疾病。

此外，本研究提示軟骨組織中的NFAT1水平上調(diào)，表明關(guān)節(jié)炎患者軟骨組織中的炎癥反應(yīng)被激活，是導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨損傷的直接原因。本研究的特色之一是分析不同病理參數(shù)的兩指標(biāo)水平，發(fā)現(xiàn)均與病理參數(shù)相關(guān)，如在年齡、類型、病程、ISOA、K-L放射線分級(jí)及嚴(yán)重程度上有差異，且病情嚴(yán)重者的水平較高，提示可用于疾病的診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)，如崔英霞等〔10〕將Col2α1基因突變情況用于先天性脊柱骨骺發(fā)育不良的產(chǎn)前診斷，具有一定的臨床價(jià)值。

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